Page 82 - 《中国药房》2023年23期
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2.2 BMECs-PC12 共培养体系构建和 OGD/R 损伤模                   细胞中LDH活性。
          型的建立                                                2.5 PC12细胞中BDNF水平的检测
              分 别 取 PC12 细 胞 和 BMECs，以 磷 酸 盐 缓 冲 液               “2.4”项下实验结束后，取板底PC12细胞的培养液，
         （PBS）洗涤 2 次，加入 0.25% 胰酶置于 37 ℃培养箱中消                  然后按 ELISA 试剂盒说明书方法操作，检测 PC12 细胞

          化 5 min；当 80% 细胞收缩变圆并漂浮时，向 PC12 细胞                  中BDNF水平。
          中立即加入含 10%FBS 的 DMEM/RPMI 1640 培养基终                 2.6 PC12 细胞中 TrkB、Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA
          止消化，向 BMECs 中加入含 20%FBS 的 DMEM/F12 培                表达水平的检测
          养基终止消化；将两种细胞以1 000 r/min离心5 min，收                       采用荧光定量 PCR 法进行检测。“2.4”项下实验结
          集管底细胞沉淀，加入培养基重悬，调整 PC12 细胞、                         束后，取部分PC12细胞进行裂解，然后用相应试剂盒提
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          BMECs 的 密 度 分 别 至 1.0×10 、4.0×10 个/mL。 将            取总 RNA，逆转录合成 cDNA，再以 cDNA 进行 PCR，反
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          PC12 细胞接种于 6 孔板中，待其生长 1 d 后用于共培养                    应条件为：50 ℃预处理 2 min；95 ℃预变性 2 min；95 ℃
          实验。将BMECs接种于已提前包被好明胶的Transwell                      变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸7 min，循环40次。
          小室内侧，将插入室放入已接种PC12细胞的6孔板中共                          以GAPDH为内参，采用2        －ΔΔCt 法检测PC12细胞中TrkB、
          培养2 d。当两种细胞生长密度达90%时，检测BMECs-                       Plc-γ、Map-2、GAP-43 mRNA的表达水平。
          PC12 共培养体系的跨膜电阻（transendothelial electronic         2.7 统计学方法
          resistance，TEER）、PC12 细胞中 LDH 活性；当 BMECs-               采用 GraphPad Prism 8.0.1 软件进行统计学分析。
          PC12 共培养体系的 TEER 和其中 PC12 细胞中 LDH 活                 数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析；符

          性 相 较 于 两 种 细 胞 单 独 培 养 显 著 升 高 时 ，则 表 明            合正态分布且方差齐时，组间两两比较采用 Dunnett’s t
                                        [10]
          BMECs-PC12共培养体系构建成功 。                               检验；不符合正态分布时，采用秩和检验。检验水准
              将上述BMECs-PC12共培养体系取出，弃掉原培养                      α＝0.05。
          基，以PBS清洗细胞后，换入无糖无血清培养基，置于含                          3 结果
          1%O2的37 ℃恒温恒湿培养箱中进行氧糖剥夺；8 h后取                       3.1 原代BMECs的分离鉴定结果
          出，弃去无糖无血清培养基，换入新鲜的完全培养基，置                               结果显示，显微镜下Ⅷ因子呈红色，原代BMECs培
          于含 5%CO2的 37 ℃恒温恒湿培养箱中进行复糖复氧                        养成功。结果见图1。
          10 h；复糖复氧结束后，检测BMECs-PC12共培养体系4 h
          渗漏液面差、TEER、PC12 细胞中 LDH 活性，当 4 h 渗漏
          液面差增大，TEER、PC12细胞中LDH活性降低时，表明
                                                   [10]
          BMECs-PC12共培养OGD/R损伤模型构建成功 。
                                                                                100 μm                   100 μm
          2.3 分组与给药
                                                                       A. DAPI                 B. Ⅷ因子
              将 BMECs-PC12 共培养体系分为对照组、模型组、
          NBP 组（阳性对照组，0.1 mmol/L，浓度参考文献[11]设
                                                  [7]
          置）、3，4-DD组（0.1 μmol/L，浓度依据前期研究 设置），
          每组均设置4个复孔。NBP组和3，4-DD组给予相应药
          物干预 Transwell 小室内侧 BMECs 24 h，对照组和模型                                              100 μm
          组以等量培养基代替，然后除对照组外，其余各组均按                                                 C. Merge
         “2.2”项下方法复制 BMECs-PC12 共培养 OGD/R 损伤                          图1 原代BMECs的分离鉴定结果

          模型。                                                 3.2 3，4-DD 对共培养体系 OGD/R 损伤模型的 TEER
          2.4 BMECs-PC12 共培养体系的 TEER 和 PC12 细胞                以及PC12细胞中LDH活性及BDNF水平的影响
          中LDH活性的检测                                               与对照组比较，模型组BMECs-PC12共培养体系的
              氧糖剥夺 8 h/复糖复氧 10 h 后，采用 ERS-2 型电阻               TEER 以及 PC12 细胞中 LDH 活性和 BDNF 水平均显著
          仪检测 BMECs-PC12 共培养体系的 TEER，取平均值。                    降 低（P＜0.01）；与 模 型 组 比 较 ，NBP 组 、3，4-DD 组
          上述检测结束后，取体系中部分PC12细胞进行裂解，然                          BMECs-PC12 共培养体系中上述指标均显著逆转（P＜
          后离心取上清液，按试剂盒说明书方法操作，测定PC12                          0.05或P＜0.01）。结果见表2。


          · 2888 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 23                            中国药房  2023年第34卷第23期
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