Page 81 - 《中国药房》2023年23期

整体稳态。脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemic reper‐ 试盒（批号 QS1001）购自南京建成生物工程研究所；
fusion injury，CIRI）发生后，BMECs、胶质细胞被激活， BDNF 酶 联 免 疫 吸 附 测 定（ELISA）试 剂 盒（批 号
血脑屏障通透性发生改变，神经元受损凋亡，导致NVU K2401874）购自武汉华美生物工程有限公司。酪氨酸激
的稳态失衡，从而影响神经系统功能 [1―2] 。相关研究发 酶受体 B（tyrosine kinase receptor B，TrkB）、磷脂酶 c-γ
现，在NVU微环境中，BMECs不仅可为神经元提供突触 （phospholipase c-γ，Plc-γ）、微管蛋白2（microtubule asso‐
间信号传递时所需要的能量，还可在CIRI情况下通过释 ciated protein-2，Map-2）、神经调节素 43（growth associ‐
放脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic fac‐ ated protein-43，GAP-43）的引物由昆明硕擎生物技术有
tor，BDNF）调控神经元活性，发挥神经保护作用 [3―4] 。因 限公司合成，具体信息见表1。
此，通过药物干预加强 BMECs 与神经元之间的信号联 表1 引物序列及扩增产物长度
系以促进机体自身的内源性修复，对CIRI的治疗具有重 基因名称 引物序列（5′→3′） 扩增产物长度/bp
要的意义。 GAPDH 上游：GATGGTGAAGGTCGGTGTGA 77
下游：AACTTGCCGTGGGTAGAGTC
本课题组前期研究表明，天麻主要活性成分3，4-二
TrkB 上游：ATCGATATCCGTGCCGGTTTA 113
羟基苯甲醛（3，4-dihydroxybenzaldehyde，3，4-DD）具有 下游：GGCTGCATGGTCCTATACGC
减轻大脑中动脉闭塞再灌注（middle cerebral artery oc‐ Plc-γ 上游：TACTCTACCGCACCCGGTTA 73
下游：CGTACAGTTTCAGCATGGCG
clusion/reperfusion，MCAO/R）模型大鼠脑损伤，保护受
Map-2 上游：AGCCAGAACATACCACCAGC 123
损神经元的作用 [5―7] ，但作用机制尚不明确。目前常以 下游：CCTCTCGTCAGCCATCCTTC
[8]
神经元和 BMECs 共培养模拟 NVU ，但是由于原代神 GAP-43 上游：CAAGATGGTGTCAAACCGGAG 157
下游：TGGTGCATCACCCTTCTTCTC
经元生长周期长，无法进行传代，故常用中分化型的大
[9]
鼠肾上腺嗜铬细胞 PC12 代替神经元进行研究 。基于 1.3 细胞
此，本研究采用Transwell小室建立BMECs-PC12共培养 大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12购自北京北纳创联生物
氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen and glucose deprivation/re‐ 技 术 研 究 院 ，将 其 以 DMEM/RPMI 1640 培 养 基（含
perfusion，OGD/R）损伤模型，探讨 3，4-DD 对 CIRI 的改 10%FBS，40 U/mL 青链霉素双抗）于 37 ℃、5%CO2及饱
善作用及机制，以期为CIRI的治疗药物开发提供参考。 和湿度的培养箱中进行培养。
1 材料 1.4 动物
1.1 主要仪器 本研究所用动物为 SPF 级 SD 大鼠，体重 250～300
3111 型 CO2细胞培养箱、QuantStudio 5 型实时荧光 g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可
定量聚合酶链式反应（PCR）仪购自美国 Thermo Fisher 证号为 SCXK（辽）2015-0001。取成年雌鼠 1 只、雄鼠 2
Scientific 公司；Ti-S 型倒置相差显微镜购自日本 Nikon 只进行合笼饲养，于第2天观察鼠笼底层是否有阴栓，于
公司；Infinite M200 PRO型酶标仪购自瑞士Tecan公司； 见到阴栓之日将雌鼠与雄鼠分开饲养，等待雌鼠生产。
ERS-2型细胞电阻仪、Transwell小室（孔径0.4 μm，有效 饲养环境温度 22～24 ℃，湿度 50%～60%，12 h 明暗交
2
膜面积0.33 cm）购自美国Millipore公司。 替。动物实验均经云南中医药大学动物保护委员会批
1.2 主要药品与试剂 准（批准号为R-06202003）。
3，4-DD（批号256775）购于北京百灵威科技有限公 2 方法
司；丁苯酞（NBP，批号118170230）购于石药集团恩必普 2.1 原代BMECs分离、培养和鉴定
TM
药业有限公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA 取出生 7 d 的乳鼠大脑皮质，用无菌组织剪将皮层
Eraser（批号AGH1533A）购自日本Takara公司；0.25%胰 组织剪碎，1 000 r/min 离心 3 min；弃除上清液后按 1∶1
蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（批号分别为 的体积比加入 BSA 溶液，并充分吹打混匀，2 500 r/min
03-050-1A、04-01-1A）购自以色列 Biological Industries 离心 8 min；弃去上清液，收集管底微血管段沉淀，然后
公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（批号 接种于 DMEM/F12 培养基（含 20% FBS、40 U/mL 青链
033100g）购自美国 Amresco 公司；DMEM/F12 培养基、 霉素双抗）的明胶包被培养瓶中，于37 ℃细胞培养箱中
DMEM/RPMI 1640 培养基（批号分别为 CLL330500B、 进行培养；24 h 后更换新鲜培养液，细胞生长状态稳定
58903）购自美国Gibco公司；兔抗Ⅷ因子单克隆抗体（批 后每2 d换液1次。待细胞生长密度达90%，进行传代纯
号 NB10091761Cy）购自美国 Novus Biologicals 公司；山 化，取传至第3代的细胞用于实验。取部分BMECs以Ⅷ
羊抗兔荧光单克隆抗体（二抗，批号 C2306）购自美国 因子抗体染色后在荧光显微镜下观察，当出现Ⅷ因子阳
Sigma公司；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测 性表达（呈红色）时，则表明原代BMECs培养成功。

中国药房 2023年第34卷第23期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 23 · 2887 ·