Page 76 - 《中国药房》2023年23期
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0003。所有小鼠均饲养于重庆医科大学实验动物中心，                          ECL化学发光显影。采用ChemiDoc XRS凝胶成像系统
          饲养环境温度为（22±2） ℃、相对湿度为 55%、12 h 光                    进行信号扫描，并使用 Image J 软件对扫描的蛋白条带
          照/12 h 黑暗循环。经过 1 周基础饲料适应性喂养后进                       灰度值进行定量分析。以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）
          行后续实验。本研究经陆军军医大学动物伦理委员会                             条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
          审核批准，伦理批件编号为AMUWEC20223914。                         2.2 体外实验
          1.4 细胞系                                             2.2.1 细胞培养及分组、造模、给药
              人肝癌 HepG2 细胞系（货号 CL-0103）购自武汉普                      使 用 含 10% 胎 牛 血 清 和 1% 青 霉 素 - 链 霉 素 的
          诺赛生命科技有限公司，经STR鉴定正确。                                DMEM完全培养基，在37 ℃、5%CO2的湿润培养箱中培
          2 方法                                                养细胞，取对数生长期细胞用于实验。体外实验设置 5
          2.1 体内实验                                            个组，分别为正常对照组、NAFLD 模型组和圣草酚低、
          2.1.1 动物分组、造模与给药                                    中、高浓度组，每组设置3个复孔。正常对照组细胞正常
              将 16 只小鼠按照体重随机分为 4 组，分别为对照                      培养，NAFLD模型组使用0.5 mmol/L油酸处理细胞，诱
          组 、NAFLD 模 型 组 和 圣 草 酚 低 、高 剂 量 组（50、100            导体外NAFLD模型 。圣草酚低、中、高浓度组在使用
                                                                               [13]
          mg/kg） ，每组 4 只。对照组小鼠提供常规饲料进行喂                       0.5 mmol/L 油酸处理细胞的同时，根据培养体系，分别
                [11]
          养，其余3组小鼠提供高脂饲料喂养4周诱导NAFLD模                          加入浓度为 0.05 mmol/L 的圣草酚母液（使用二甲基亚
            [12]
          型 ；在预处理4周后，采取腹腔注射方式（0.01 mL/g）进
                                                              砜溶解），使培养体系中圣草酚终浓度分别为 50、100、
          行给药，每日1次，连续6周。对照组小鼠每日注射生理                                     [11]
                                                              150 μmol/L 。处理 24 h 后，收取细胞样本，冻存于
          盐水，NAFLD 模型组小鼠每日注射玉米油，圣草酚低、
                                                              －80 ℃冰箱中。
          高剂量组小鼠每日分别注射相应剂量的圣草酚玉米油
                                                              2.2.2 细胞中脂质沉积观察
          溶液。
                                                                  采用尼罗红染色法进行观察。取 HepG2 细胞进行
          2.1.2 动物一般情况观察
                                                              铺板（1×10 个/孔），按 “2.2.1”项下进行分组、处理细
                                                                        5
              实验过程中，每日观察小鼠状况，每周记录小鼠体
                                                              胞，然后用4%多聚甲醛固定30 min，按照尼罗红染色试
          重变化，每2日称定并记录小鼠进食饲料的质量。
                                                              剂操作说明进行染色，最后在荧光倒置显微镜下观察细
          2.1.3 动物标本采集与处理
                                                              胞中脂滴沉积情况，如有脂滴沉积可见细胞内有绿色高
              给药结束后，各组小鼠禁食不禁水 24 h，经眼球取
                                                              亮荧光。
          血，以3 000 r/min离心10 min，分离血清，－20 ℃冰箱中
                                                              2.2.3 细胞中TG、MDA和ROS水平测定
          保存。取血后，脱颈处死小鼠，取出肝脏，用冷生理盐水
                                                                  取“2.2.1”项下冻存的细胞样本，复温，以功率300 W
          冲洗，用滤纸吸干后对小鼠肝脏大体进行观察并拍照。
                                                              超声（超声 5 s 间隔 30 s，重复 5 次）破碎细胞，按照试剂
          称定肝脏质量，取部分肝组织用4%多聚甲醛固定，其余
                                                              盒说明书操作，测定细胞中TG、MDA和ROS水平。
          组织分装在EP管内，置于－80 ℃冰箱中保存。
                                                              2.2.4 细胞中 MAPK 和 Nrf2/HO-1 信号通路蛋白表达
          2.1.4 血清中AST、ALT和TG水平测定
                                                              检测
              取冻存的血清，常规解冻后，按照相应试剂盒说明
                                                                  取“2.2.1”项下冻存的细胞样本，复温后加入蛋白裂
          书操作，检测小鼠血清中AST、ALT和TG水平。
                                                              解液，冰上裂解30 min提取总蛋白，采用BCA法测定蛋
          2.1.5 肝组织病理变化观察
                                                              白浓度。将蛋白高温变性后，取 40 μg 蛋白上样，参照
              取“2.1.3”项下经固定处理的肝组织，进行常规石蜡
          包埋切片（4 μm）后行常规苏木素-伊红（HE）染色，在荧                      “2.1.6”项下方法检测细胞中 MAPK 和 Nrf2/HO-1 信号
          光倒置显微镜下观察肝组织病变情况。                                   通路相关蛋白的表达。其中，ERK、p-ERK、JNK、p-
          2.1.6 肝组织中Nrf2、HO-1蛋白表达检测                           JNK、Nrf2、HO-1 和 β-actin（内参）一抗的稀释比例均为
              采用 Western blot 法进行检测。取“2.1.3”项下冻存              1∶1 000，二抗的稀释比例为1∶8 000。使用Image J软件
          的小鼠肝组织，使用高通量匀浆机将肝组织研磨后，加                            分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参蛋白条带灰度
          入Western及IP细胞裂解液提取总蛋白，采用BCA法测                       值的比值表示目标蛋白的表达水平，以 p-ERK 与 ERK、
          定总蛋白浓度。将蛋白高温变性后，取 40 μg 变性蛋白                        p-JNK与JNK蛋白表达的比值分别表示ERK、JNK蛋白
          进行 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压                         的磷酸化水平。
          80 V、电泳时间 20 min；电压 120 V、电泳时间 40 min），             2.3 统计学方法
          湿法转膜（电流 400 mA、转膜120 min），加入5%脱脂奶                       采用 Graphpad Prism 8.0 软件进行统计分析。计量
          粉封闭 2 h；使用 TBST 洗膜 3 次、5 min/次，加入 Nrf2、             资料以 x±s 表示，多组间均数比较采用单因素方差分
          HO-1 和 β-actin 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃孵育             析 ，两 组 间 均 数 比 较 采 用 LSD-t 检 验 。 检 验 水 准
          过夜；TBST 洗膜，加入对应二抗（稀释比例 1∶8 000），                    α＝0.05。


          · 2882 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 23                            中国药房  2023年第34卷第23期
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