Page 87 - 《中国药房》2023年20期
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2.1.2 空白纳米纤维敷料的制备                                  浓度的 PVP-PCL、P-PVP-PCL 浸提液作为 PVP-PCL 组
              按“2.1.1”项下方法操作，但在制备时，PVP 纺丝液                   和P-PVP-PCL组，同时设置不含药和细胞的培养基作为
          中不添加头花蓼提取物，并设置纺丝工艺参数中PVP纺                          空白组，不含药只含细胞的培养基作为对照组，每组设
          丝液的纺丝电压为11 kV，即得空白纳米纤维敷料（以下                        置 6 个复孔。培养 24 h 后，弃去孔内培养基，每孔加入
          简称“PVP-PCL”）。                                      100 μL无血清MEM培养基，然后在避光条件下加入10
          2.1.3 P-PVP-PCL的微观形貌表征                             μL 质量浓度为 5 mg/mL 的 MTT 溶液，培养 4 h 后，弃去
              利用扫描电子显微镜观察P-PVP-PCL的微观形貌；                     孔内培养基，每孔加入 100 μL 二甲基亚砜，充分振荡。
          选取 100 根纳米纤维，使用 Image J 1.8.0 软件测量纳米               之后，使用酶标仪于 490 nm 处检测各孔的 OD 值，并根
          纤维的平均直径和孔隙率，并使用 OriginPro 2021 软件                  据下列公式计算各组细胞存活率，细胞存活率（%）＝
          分析纳米纤维直径。                                         （OD 敷料 －OD 空白）/（OD 对照 －OD 空白）×100%。 实 验 重
          2.2 P-PVP-PCL的体外药效研究                               复3次。
          2.2.1 抑菌活性评价                                       2.2.4 细胞黏附实验
              采用麦氏比浊法将细菌悬液浓度调整至 1×10                             取P-PVP-PCL和医用纱布敷料，剪成直径为1.5 cm
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          cfu/mL。分别取 100 mg 经紫外线照射灭菌后的 PVP-                  的圆形，分别置于 24 孔板底部的其中一个孔中，以 1×
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          PCL 和 P-PVP-PCL 于无菌试管中，再分别加入 5 mL 浓                10 个/mL 的密度在敷料上接种 L929 细胞，于 37 ℃、
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          度为 1×10  cfu/mL 的金黄色葡萄球菌悬液和大肠埃希                    5%CO2恒温恒湿培养 3 d。孵育结束后，用磷酸盐缓冲
          菌悬液，于 37 ℃、200 r/min 恒温孵育 24 h。孵育结束                液洗涤敷料3次，用2.5%戊二醛于4 ℃条件下固定2 h。
          后，分别取100 μL悬液置于96孔板中，每组设6个复孔，                      分别在不同体积分数梯度（30%、50%、70%、90%、100%）
          用酶标仪检测其在600 nm波长处的光密度（optical den‐                 的乙醇溶液中进行脱水处理，每个乙醇梯度下脱水 10
          sity，OD）。另将不含菌悬液的试管作为空白，不含敷料                       min，冷冻干燥过夜，利用扫描电子显微镜观察细胞的黏
          的试管作为对照。根据下列公式计算敷料的抑菌活性，                           附情况。实验重复3次。
          抑菌活性（%）＝[1－（OD 敷料－OD 空白 ）/（OD 对照－OD 空白 ）]×         2.2.5 细胞迁移实验
          100%。为了观察敷料对细菌生长的影响，另取上述孵                              以 1×10 个/mL 的密度将细胞接种于 6 孔板中的 3
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          育后的菌悬液稀释100倍后，各取20 μL涂布于LB固体                       个孔中，待细胞 100% 铺满孔板底部时，用 200 μL 无菌
          培养基上，于37 ℃条件下培养16 h，观察培养基上菌落                       枪头划3条直线，弃去孔内培养基，用磷酸盐缓冲液缓慢
          的生长情况。实验重复3次。                                      清洗细胞2～3次。3个孔分别加入2 mL的无血清MEM
          2.2.2 抗氧化活性评价                                      培养基（对照组）、0.25 mg/mL PVP-PCL 浸提液（PVP-
              采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法评价抗氧                   PCL 组）和 0.25 mg/mL P-PVP-PCL 浸提液（P-PVP-PCL
          化活性。取PVP-PCL、P-PVP-PCL各10 mg，分别浸入含                 组），继续培养。分别于0、24、48 h时拍照记录细胞迁移
          0.1 mmol/L DPPH 的乙醇溶液中，于室温避光条件下分                   的情况，并根据下列公式计算各组细胞迁移率，细胞迁
          别培养30 min、24 h；另将含0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶              移率（%）＝（0 h 时划痕面积－设定时间点下的划痕面
          液作为对照。培养结束后，分别于517 nm波长下，采用                        积）/0 h时划痕面积×100%。实验重复3次。
          紫外分光光度计检测各组吸光度（A）。实验重复 3 次。                        2.3 P-PVP-PCL的体内药效研究
          根据下列公式计算抗氧化活性，抗氧化活性（%）＝                            2.3.1 造模、分组与给药
         （A 对照－A 样品 ）/A 对照×100%。                                 取大鼠 36 只，麻醉后对背部皮肤进行脱毛处理，用
          2.2.3 细胞活性检测                                       手术剪剪一个直径约 1.5 cm 的圆形全层皮肤伤口。将
             （1）药液的制备：将PVP-PCL、P-PVP-PCL置于紫外                 大鼠随机分为医用纱布敷料组、PVP-PCL 组和 P-PVP-
          灯下照射，正反面分别照射 3 h 以上；之后，分别用无血                       PCL组，每组12只。每组大鼠分别用相应的敷料覆盖创
          清的 MEM 培养基培养 24 h，过 0.22 μm 无菌微孔滤膜，                面，最外层用绷带进行固定，每2 d更换一次敷料。
          根据预实验结果，制成质量浓度分别为0.05、0.10、0.25、                   2.3.2 创面愈合情况观察
          0.50、1.00 mg/mL的浸提液。                                   观察并拍照记录伤口愈合情况。根据公式计算干
             （2）细胞分组处理及活性检测：将 L929 细胞以 1×                    预第3、7、14天时的创面愈合率，创面愈合率（%）＝（第0
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          10 个/孔接种于 96 孔板中，于培养箱中培养，待细胞贴                      天创面面积－第3/7/14天创面面积）/第0天创面面积×
          壁后弃去原培养基，分别加入“2.2.3（1）”项下不同质量                      100%。


          中国药房  2023年第34卷第20期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 20    · 2509 ·
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