Page 66 - 《中国药房》2023年20期

功的大鼠随机分为模型组、虾青素低剂量组（20 mg/kg）、
虾青素高剂量组（40 mg/kg）、虾青素+ML385组（40 mg/kg
虾青素+30 mg/kg ML385），每组 14 只。虾青素用二甲
基亚砜溶解并用生理盐水稀释，配制成2、4 g/L的药液，
以10 mL/kg灌胃；ML385用二甲基亚砜溶解并用生理盐
水稀释，配制成3 g/L的药液，以10 mL/kg腹腔注射。虾
青素低、高剂量组大鼠分别灌胃20、40 mg/kg的虾青素；
虾青素+ML385组大鼠在灌胃40 mg/kg虾青素的同时腹
腔注射30 mg/kg的ML385；假手术组和模型组大鼠灌胃
等体积的生理盐水（含二甲基亚砜）；每天1次，连续7 d。
[11]
虾青素的成人日推荐摄取量为4～50 mg ，按人与大鼠
体表面积比换算得大鼠等效剂量为20 mg/kg，以此作为
低剂量，其2倍作为高剂量。ML385的剂量参考相关文
[12]
献 设置。
2.2 大鼠神经功能评估
分别于药物干预后第 1、3、7 天，应用 Garcia 评分对
各组大鼠的神经功能缺损程度进行评估。最高分为 18
[13]
分，评分越低表示神经功能缺损越严重 。
2.3 大鼠脑组织形态学变化观察及炎症浸润评分
药物干预后第7天，各组取4只大鼠处死，提取其脑
组织并保存于－80 ℃冰箱中，待用。取上述大鼠的损伤
区脑组织（假手术组取相同位置脑组织）适量，用 4% 多
聚甲醛溶液固定后，行常规石蜡包埋、切片，经苏木精-
伊红（HE）染色后使用显微镜观察其脑组织形态学变化
情况，并进行炎症浸润评分，具体标准如下：无炎症细胞
浸润，记0分；有少量散在炎症细胞浸润，记1分；小血管
周围可见“血管套”结构，记2分；可见大面积广泛炎症细
[14]
胞浸润，记3分 。
2.4 大鼠脑组织神经细胞超微结构观察
取“2.3”项下各大鼠余下缺损区脑组织（假手术组取
相同位置脑组织），切成2 mm厚的组织块，于2.5%戊二
醛电镜固定液中静置6 h，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，
再用1%四氧化锇磷酸缓冲液固定，行丙酮脱水、环氧树
脂618原位包埋、切片，经枸橼酸铅和醋酸双氧铀染色后
使用透射电镜观察并拍照，记录其脑组织神经细胞超微
结构改变情况。
2.5 大鼠脑组织氧化应激和炎症反应相关指标检测
末次给药1 h后，处死各组剩余10只大鼠，取其损伤
区脑组织（假手术组取相同位置脑组织）适量，制备脑组
织匀浆，通过化学比色法检测大鼠脑组织中氧化应激指
标（SOD、CAT、GSH-Px、MDA、NO）的含量，通过ELISA
法检测其脑组织中炎症反应指标（TNF-α、IL-1β、IL-6、
iNOS）的含量。上述操作均严格按照相应试剂盒说明书
执行。
· 2492 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 20
2.6 大鼠脑组织中 Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA 表达水
平检测
采用实时 PCR（real-time PCR，RT-PCR）法进行检
测。取“2.5”项下各大鼠损伤区脑组织（假手术组取相同
位置脑组织）适量，采用Trizol法提取总RNA，检测RNA
浓度后将其反转录为 cDNA。以上述 cDNA 为模板，进
行PCR扩增，严格按照相应试剂盒说明书操作。反应体
系包括：10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP混合液3 μL，上、
下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 1 μL，TaqDNA 聚合酶 1
μL，Mg 1.5 μL，加水（经焦碳酸二乙酯处理）至25 μL。
2+
反应条件如下：94 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，55 ℃
退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；最后72 ℃再延伸5
min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，采用
2 －ΔΔCt 法计算 Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA 的相对表达水
平。Nrf2 的上、下游引物分别为 5′-TCAGCGACTGTC-
ACTCGATGA-3′、5′-CCACTGGTCGTGGAGTGGATG-
3′；HO-1 的上、下游引物分别为 5′-GGGTCGTCAGTA-
CCAGTTTC-3′、5′-CCAGGCATCGGCAGCAATTC-3′；
NQO1 的上、下游引物分别为 5′-ATCCTGCGCTACT-
GCGACTT-3′、5′-GCATGCTAGAGTGTTCTCTCCT-3′；
GAPDH的上、下游引物分别为5′-CTCGCTTCTGAAG-
CACA-3′，5′-AACGCTGCTCGAATTTGCGT-3′。
2.7 大鼠Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达水平检测
采用Western blot法进行检测。取“2.5”项下各大鼠
损伤区脑组织（假手术组取相同位置脑组织）适量，加入
RIPA裂解液提取总蛋白，于沸水中加热10 min变性；取
变性蛋白适量，经电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜
上，以 5% 脱脂奶粉封闭 1 h；用 TBST 缓冲液清洗 2
min×3次，加入Nrf2、HO-1、NQO1、β-actin一抗（稀释比
例均为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜；用 TBST 缓冲液清洗 2
min×3次，加入相应二抗（稀释比例为1∶2 000），室温孵
育1 h；用TBST缓冲液清洗2 min×3次，加入ECL显色，
置于多功能成像仪下成像，并采用Image J 5.0软件进行
分析，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比值表
示各目的蛋白的相对表达水平。
2.8 统计学方法
采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资
料用 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
3 结果
3.1 各组大鼠的神经功能评分
与假手术组比较，模型组大鼠第 1、3、7 天时的神经
功能评分均显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，虾青
素高剂量组大鼠在药物干预第1天时和虾青素低、高剂
量组大鼠在药物干预第3、7天时的神经功能评分均显著
升高（P＜0.05），且随着虾青素干预时间的延长，大鼠神
经功能评分有升高的趋势。与同期虾青素高剂量组比
中国药房 2023年第34卷第20期