Page 59 - 《中国药房》2023年20期
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2 方法                                               缺血术后存活的大鼠，常规饲养1周后，分笼（每笼1只）
          2.1 网络药理学研究                                        喂养，并给予慢性不可预见的温和应激，即随机接受不
          2.1.1 MBD/BDD 活性化合物的鉴定及其靶基因集的                      同刺激源[夹尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、45 ℃下静置
          筛选                                                 5 min、明暗颠倒24 h、水平振荡30 min（频率160次/min）、
              使用ETCM数据库（http：//tcmspw.com/）分析MBD/            4 ℃冰水中游泳 5 min]刺激，每天 1～2 种，每种 3 次，连
          BDD的化合物组成，并鉴定7种组方药材中包含的所有                          续21 d，以复制PSD模型大鼠。
          化合物。以每味中药的名称作为关键词，在ETCM数据                              将所得 PSD 模型大鼠随机分为 PSD 模型组、MBD/
          库中检索MBD/BDD的活性成分及其相关靶点，去重后                         BDD 组[12.6 g/kg，以生药总量计，按照成人临床用量
          分别得到MBD/BDD的活性化合物及其靶基因集。                           1.8 g/（kg·d）的 7 倍换算而得]、FLX 组[阳性对照，2.3
          2.1.2 MBD/BDD抗抑郁相关基因集的筛选                           mg/kg，按照成人临床用量0.33 mg/（kg·d）的7倍换算而
              以“depression”“antidepressants”“depressive  disor‐  得]，另设空白对照组（该组大鼠接受相同的手术操作但
          der”等为检索词，通过 GeneCards 数据库（https：//gene-           不插入缝线，亦不接受任何刺激），每组 8 只。MBD/
          cards.org/）和OMIM数据库（https：//omim.org/）获取抑郁         BDD 组和 FLX 组大鼠灌胃相应药液（以水为溶媒），空
          症相关靶点。对GeneCard数据库中相关性得分大于10                       白对照组和 PSD 模型组大鼠灌胃等体积水，每天 1 次，
          的基因和OMIM数据库中的所有基因进行筛选，得到抑                          连续21 d。
          郁症相关靶基因集，并将其与“2.1.1”项下所得 MBD/                      2.2.2 行为学测试
          BDD 靶基因集进行交叉，取交集，即得 MBD/BDD 抗抑                        （1）旷场实验（open field test，OFT）：于第 20 天给药
          郁相关基因集。                                            结束后进行OFT。实验装置为100 cm×100 cm×60 cm
          2.1.3 组分-靶点网络与蛋白质-蛋白质相互作用网络的                       的开放式盒子，盒子底部被分成 25 个面积相等的正方
          构建                                                 形。将所有大鼠放置在盒子的中心，记录其 5 min 内在
              将“2.1.1”项下的 MBD/BDD 活性化合物靶基因和                  中心方格花费的总时间及其行进的总距离。每只大鼠
         “2.1.2”项下的MBD/BDD抗抑郁相关基因作为节点，使                      单独测试1次。
          用Cytoscape可视化软件构建组分-靶点网络（网络中，连                        （2）强迫游泳实验（forced swimming test，FST）：于
          线表示节点间的相互作用）。以“2.1.2”项下 MBD/BDD                    第21天给药结束后，将所有大鼠置于装满水的独立玻璃
          抗抑郁相关基因集对应的靶蛋白为对象，借助 STRING                        圆柱体[圆柱体高60 cm，直径40 cm；水温（20±2）℃，水
          数据库（https：//cn.string-db.org/），限定物种为“homo sa‐      位高 30 cm]中，待其游泳适应 2 min 后，记录其 5 min 内
          piens”，采用 Cytoscape 可视化软件构建蛋白质-蛋白质                 的累计游泳不动时间（以活动减少且间断出现不动或飘
          相 互 作 用（protein-protein  interaction，PPI）网 络 ，并 以  浮状态仅露出口鼻为“不动”）。
         “TSV”格式保存。                                          2.2.3 转录组测序与生物信息学分析
          2.1.4 京都基因和基因组数据库通路富集分析                                FST 后，各组大鼠经 0.9% 戊巴比妥钠（5 mL/kg，腹
              京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of              腔注射）麻醉后处死，剖取其脑组织并提取总RNA，进行
          Genes and Genomes，KEGG）通路分析可用于发现药物                 样品制备、文库构建和 DNA 成簇扩增。对脑组织中的
          作用的关键信号通路。本研究使用 R 3.4.0 软件中的                       RNA进行高通量测序以获得所有转录本序列信息，从而
         “clusterprofile”包，以 P＜0.05 为标准进行 KEGG 通路的           挖 掘 差 异 表 达 基 因（differentially  expressed  genes，
          富集、筛选。                                             DEGs）；对所得DEGs进行基因本体（gene ontology，GO）
          2.2 动物实验                                           富集分析，基于DisGeNET数据库（https：//www.disgenet.
          2.2.1 造模、分组与给药                                     org/）进行疾病相关性富集分析，基于美国国立卫生研究
              首先，对大鼠进行局灶性脑缺血手术：大鼠禁食、不                        院基因数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）进行
                                                                            [17]
          禁水 12 h，经 0.9% 戊巴比妥钠（5 mL/kg，腹腔注射）麻                生物信息学分析 。转录组测序由北京诺禾医学检验
          醉，以仰卧位固定，对其颈部皮肤消毒后于颈部中线切                           实验室有限公司完成。
          口，暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉；结扎颈外                          2.2.4 靶基因及蛋白表达的验证
          动脉，用动脉夹夹闭左侧颈总动脉及颈内动脉，于左侧                               结合上述转录组测序和生物信息学分析结果，选取
          颈总动脉作一楔形切口，将带有略微扩大的圆形尖端                            其中上调较显著的基因进行mRNA水平表达验证（实时
         （直径0.235～0.260 mm）的尼龙单丝缝线从颈外动脉轻                     qPCR法），选取2个常见的神经营养因子进行蛋白水平
                                            [16]
          轻推入颈内动脉管腔并固定，造成缺血 。随后，取脑                           表达验证（Western blot法）。

          中国药房  2023年第34卷第20期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 20    · 2485 ·
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