Page 41 - 《中国药房》2023年20期
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（n＝6），相对峰面积的 RSD 均不高于 3.42%（n＝6），说                  中，于37 ℃、5%CO2、75%相对湿度条件下培养；6 h后，更
          明方法重复性良好。                                          换培养液，继续培养，待单层细胞融合至80%后传代培养。
             （3）稳定性考察：精密称取“2.1.3”项下供试品溶液                     2.2.2 病毒毒力测定
                                                                                      4
         （编号 S3 ），分别于室温静置 0、2、4、8、12、24 h 时按                     将Hep-2细胞以1.5×10 个/孔接种于96孔板中，于
         “2.1.1”项下色谱条件进样测定。以13号峰为参照峰，计                       37 ℃、5%CO2下培养 12 h。RSV 病毒液按 10 倍比用细
          算得各共有峰相对保留时间的 RSD 均不高于 0.68%                       胞维持液（即含2%胎牛血清的DMEM培养液，下同）稀
                                                                                －8
         （n＝6），相对峰面积的 RSD 均不高于 3.12%（n＝6），说                  释 8 个梯度（即 1×10 ～1×10 ），加至长成单层的细
                                                                                        －1
          明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。                            胞中培养 36 h（每个病毒稀释度设置 6 孔），采用致细胞
          2.1.5 指纹图谱建立及相似度评价                                 病变效应（cytopathic effect，CPE）法观察病毒感染情况，
              取20批裸花紫珠醇提物样品各适量，采用“2.1.3”项                    按照 Reed-Muench 公式 计算得 RSV 的病毒滴度为
                                                                                  [12]
                                                                    7
          下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样                       3.4×10  TCID50/mL（TCID50为半数组织培养物感染量）。
          分析，记录色谱图；将图谱信息导入《中药色谱指纹图谱                          2.2.3 裸花紫珠醇提物细胞毒性及抗RSV活性测定
          相似度评价系统（2012 版）》，以编号 S3样品的图谱为参                         将 20 批裸花紫珠醇提物样品研细后分别溶于细胞
          照，将时间窗宽度设为0.1 s，经多点校正自动匹配，生成                       维持液中，得质量浓度为1 mg/mL的供试药液。将Hep-
          叠加指纹图谱；经 Mark 峰匹配，最终确定了 25 个共有                     2 细 胞 以 1.5×10 个/孔 接 种 于 96 孔 板 中 ，于 37  ℃ 、
                                                                            4
          峰，并以中位数法生成了对照图谱（R），具体见图1。                          5%CO2下培养12 h。将细胞分为空白对照组、模型对照
           1 200              13                             组、药物组（裸花紫珠醇提物质量浓度分别为 0.5、0.25、
           1 100  2 4      10 11  15 16  19 20 21  22        0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625、0.007 812 5 mg/mL，
                1 3 5 6  78  9  12  14  17  18  23  24 25
           1 000                                       R
                                                       S20
            900                                        S19   质量浓度按前期预实验结果设置），每组设置3个复孔。
                                                       S18
            800                                        S17
                                                       S16   除空白对照组外，其余各组细胞均接种 100 个 TCID50的
                                                       S15
           U/mV 700                                    S14   病毒液（病毒加入量根据“2.2.2”项下结果设置），药物组
                                                       S13
            600
            500                                        S12
                                                       S11
                                                       S10   细胞同时加入相应药液。培养36 h后，采用CPE法观察
            400                                        S9
                                                       S8
            300                                        S7    病毒感染情况，采用MTT法，以酶标仪于490 nm波长处
                                                       S6
            200                                        S5
                                                       S4
            100                                        S3    检 测 各 孔 的 光 密 度（OD）值 来 评 估 细 胞 活 力 ，通 过
                                                       S2
             0                                         S1    GraphPad Prism 5 软件拟合裸花紫珠醇提物对 Hep-2 细
               0  2  4  6  8 10  12  14  16  18  20  22  24  26  28  30  32  34  36  38  40  42
                                  t/min                      胞的半数毒性浓度（CC50 ）和对 RSV 病毒的半数抑制浓
         图1 20批裸花紫珠醇提物样品的叠加指纹图谱和对照
                                                             度（IC50 ），并计算TI值（TI＝CC50/IC50 ）  [13―14] 。上述实验平
               图谱
                                                             行2批进行，1批用于拟合CC50，1批用于拟合IC50。
              采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012                            结果（表1）显示，随着提取溶剂极性的减小，裸花紫
          版）》计算各样品指纹图谱与对照图谱（R）的相似度，结                         珠醇提物的细胞毒性有逐渐增强的趋势，其中S10样品的
          果显示，S1～S20样品与对照指纹图谱的相似度依次为                         细胞毒性最强，CC50为（87.03±6.85）μg/mL。20 批裸花
          0.989、0.994、0.998、0.998、0.997、0.912、0.981、0.984、   紫珠醇提物对 RSV 有不同程度的抑制作用，其中 S10样
          0.986、0.985、0.992、0.996、0.980、0.973、0.968、0.994、   品的抗 RSV 活性最强，其 IC50为（9.55±1.35）μg/mL；S15
          0.995、0.980、0.979、0.981，说明各批裸花紫珠醇提物样               样品的抗RSV活性次之，其IC50为（11.07±1.16）μg/mL；
          品所含化学成分相似，一致性较高。                                   S2 样品的 TI 值最大，为 27.53；S11 样品的 TI 值最小，
          2.1.6 共有峰峰面积差异性分析                                  为3.63。
              通过计算 20 批裸花紫珠醇提物样品指纹图谱各共                       2.3 裸花紫珠醇提物抗RSV活性的谱效关系评价
          有峰峰面积的 RSD 来进行差异性分析。结果显示，25                        2.3.1 Pearson相关性分析
          个共有峰峰面积的RSD为33.54%～162.28%，其中峰2、                       采用 SPSS 22.0 软件，对裸花紫珠醇提物指纹图谱
          6、9、14、24峰面积的RSD均超过90%，提示20批样品的                    的共有峰峰面积与 IC50进行 Z-score 标准化处理，采用
          成分含量有所差异，以峰2、6、9、14、24较为明显。                        Pearson 相关性分析对二者的关系进行评价。结果（表
          2.2 裸花紫珠醇提物体外抗RSV的药效研究                             2）显示，峰8、10、12、16、18～19、22～24的峰面积与IC50呈
          2.2.1 细胞复苏与培养                                      负相关，相关系数分别为－0.573、－0.731、－0.523、－0.531、
              将装有Hep-2细胞的冻存管置于37 ℃水浴中，使其                     －0.497、－0.452、－0.497、－0.595、－0.619（P＜0.05 或
          迅速复苏后转移至含DMEM培养液6 mL的无菌离心管                         P＜0.01）。可以推测，这 9 个共有峰对应成分可能与裸
          中，以 1 000 r/min 离心 3 min，弃去上清液；加入新鲜                花紫珠醇提物的抗 RSV 活性有关，且其峰面积越大，裸
          DMEM培养液10 mL，吹打后将细胞转移至细胞培养皿                        花紫珠提取物的IC50越小，抗RSV活性可能越强。


          中国药房  2023年第34卷第20期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 20    · 2467 ·
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