Page 46 - 《中国药房》2023年20期
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出，人参皂苷 Rh2能有效抑制大鼠 C6 胶质瘤细胞的增                        2）单克隆抗体（批号 3498T）、兔抗人 Bcl-2 相关 X 蛋白
                         [6]
          殖，并诱导其凋亡 。可见，该成分有望成为胶质瘤临床                          （Bcl-2-associated  X  protein，Bax）单 克 隆 抗 体（批 号
          辅助治疗的候选药物。                                          41162S）、兔抗人切割型胱天蛋白酶 3（cleaved caspase-
              近 年 来 的 研 究 表 明 ，组 蛋 白 脱 乙 酰 酶（histone          3）单克隆抗体（批号 9664T）均购自美国 CST 公司；ECL
          deacetylases，HDACs）的异常表达与多种恶性肿瘤的发                   化学发光显色试剂（批号 P10100）购自苏州新赛美生物
          生发展密切相关 。人类高发恶性肿瘤的最新相关研究                            科技有限公司。
                        [7]
          表明，HDAC1/醇脱氢酶 1A（alcohol dehydrogenase 1A，          1.3 细胞
          ADH1A）轴在抑制非小细胞肺癌细胞迁移并促进其凋                               人胶质瘤U87、U251细胞由重庆医科大学干细胞与
                               [8]
          亡过程中具有重要作用 ，其可通过干扰小 RNA（small                       组织工程研究室提供。
          interfering RNA，siRNA）来调控 HDAC1 的表达，进而上             2 方法
                                                  [9]
          调肝癌细胞标志物p21的表达并抑制细胞增殖 ；同时，                          2.1 细胞培养及药液配制
          有学者在另一项胶质瘤研究中指出，HDAC1 活性的增                              U87、U251 细胞用 2 倍以上体积的培养基混匀，以
                                            [10]
          强可能是肿瘤细胞生长及耐药的基础 。本课题组前                             1 000 r/min离心5 min，弃去上清液；收集细胞，用含10%
          期基于中国脑胶质瘤基因组图谱计划数据库（Chinese                         胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM高糖培养基（以
          Glioma  Genome  Atlas，CGGA），利 用 在 线 分 析 工 具         下简称“完全培养基”）重悬于培养瓶中，于 5%CO2、
         （http：//www.cgga.org.cn）对数据库中胶质瘤患者的临床                37 ℃培养箱中培养。
          样本进行分析后发现，HDAC1 mRNA 在恶性胶质瘤                             取 人 参 皂 苷 Rh2 原 料 药 20  mg，以 二 甲 基 亚 砜
         （WHO病理分级为Ⅲ、Ⅳ级）患者体内呈高表达，且其表                          （DMSO）200 μL充分溶解，配制成浓度为160 mmol/L的
          达水平与肿瘤恶性程度成正比，与患者生存率成反比。                            储备液，于－20 ℃下保存。临用前，用含10%胎牛血清
          可见，HDAC1 有望成为恶性胶质瘤的潜在治疗靶点。                          的 DMEM 高糖培养基稀释成相应浓度的药液（DMSO
          本研究以人胶质瘤细胞为对象，拟分析人参皂苷 Rh2对                          不能超过总体积的0.1%）。
          其增殖、凋亡的影响，并基于HDAC1初步探讨上述作用                          2.2 细胞增殖检测
          的可能机制，以期为进一步研究该成分的药理作用和开                                采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期的 U87、
          发恶性胶质瘤的治疗药物提供新的思路。                                  U251细胞，按5 000个/孔接种于96孔板中。将细胞分为
          1 材料                                                空白组（只加完全培养基）、对照组（不加药物）和不同浓
          1.1 主要仪器                                            度人参皂苷 Rh2组（10、20、30、40、50、60、70、80 μmol/L，
              本研究所用主要仪器包括 ChemiDoc Touch 型凝胶                  浓度参考前期预实验结果设置），每组设5个复孔。分别
          成像系统、M450 型酶标仪（美国 Bio-Rad 公司），Cyto‐                 于培养 24、48、72 h 时，加入 CCK-8 试剂 10 μL，孵育 2 h
          FLEX型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），TGL-                后，使用酶标仪在450 nm波长处检测各孔的吸光度（A）
          185 型台式高速冷冻离心机（重庆平凡仪器仪表有限公                          值，按下式计算药物作用 48 h 时的细胞增殖抑制率：细
          司）等。                                                胞增殖抑制率＝（A 对照组－A 实验组 ）/（A 对照组－A 空白组 ）；同时拟
          1.2 主要药品与试剂                                         合人参皂苷Rh2的半数抑制浓度（IC50 ）。
              人参皂苷Rh2原料药（货号78214-33-2，纯度≥98%）                 2.3 细胞凋亡检测
          购自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清和DMEM                               采用流式细胞术进行检测。取对数生长期的U87、
          高糖培养基均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；             U251 细胞，按 50 000 个/孔接种于 6 孔板中。将细胞分
          CCK-8 试剂盒（批号 K1018）购自美国 APExBIO 公司；                 为对照组（不加药物）和不同浓度人参皂苷Rh2组（30、50
          Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒（批号 WLA010a）               μmol/L，浓度参考“2.2”项下结果设置，下同），每组设 3
          购自沈阳万类生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试                           个 复 孔 。 培 养 48  h 后 ，收 集 各 组 细 胞 ，按 Annexin
          剂盒（批号P0012）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电                        Ⅴ-FITC/PI 试剂盒说明书操作，使用流式细胞仪检测其
          泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒（批号P0012A）、细胞裂                    总凋亡率。
          解液（批号P0013K）、青-链霉素双抗（批号C0222）、苯甲                    2.4 HDAC1和凋亡相关蛋白表达检测
          基 磺 酰 氟（phenylmethylsulfonyl  fluoride，PMSF；批 号         采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
          ST506）、小鼠抗人 β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批                  U87、U251 细胞，按 50 000 个/孔接种于 6 孔板中。将细
          号 AF0003）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔                       胞分为对照组（不加药物）和不同浓度人参皂苷 Rh2组
          IgG（H+L）二抗（批号 A0208）、HRP 标记的山羊抗小鼠                  （30、50 μmol/L），每组设3个复孔。培养48 h后，收集各
          IgG（H+L）二抗（批号 A0216）均购自上海碧云天生物技                     组细胞并提取其总蛋白，以 BCA 法测定蛋白浓度后作
          术 有 限 公 司 ；小 鼠 抗 人 HDAC1 单 克 隆 抗 体（批 号              变性处理。取变性蛋白适量，经SDS-PAGE分离后转移
          5356T）、兔抗人B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-            至硝酸纤维素膜上，用脱脂奶粉于室温下封闭 0.5 h；加


          · 2472 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 20                            中国药房  2023年第34卷第20期
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