Page 54 - 《中国药房》2023年19期
P. 54

到逃生平台所需要的时间，即逃避潜伏期；若在 60 s 内                        2.8 统计学方法
          没有找到平台，逃避潜伏期时间记为60 s。将大鼠放在                              采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量资料以
          逃生平台上停留20 s，增加大鼠对逃生平台的记忆力，然                         x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          后进行下一象限测试。实验第6天进行空间探索实验：                            比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          将逃生平台撤掉，将大鼠从逃生平台所在对面象限放入                            3 结果
          水池，自由游泳60 s，记录大鼠在平台象限停留的时间以
                                                              3.1 PNU-282987对TLE模型大鼠癫痫发作行为的影响
          及穿越平台的次数。
                                                                  对照组大鼠无癫痫发作。与对照组比较，模型组大
          2.4 大鼠海马组织CA1区神经元病理学形态观察                            鼠癫痫评分及发作持续时间均显著增加（P＜0.05）；与
              采用 Nissl 染色法进行观察。Morris 水迷宫实验结
                                                              模型组比较，PNU-282987 组大鼠上述指标均显著减少
          束后，每组随机选择5只大鼠麻醉并采用左心室灌流，断
          头取全脑，于 4% 多聚甲醛溶液中固定 12 h；经脱水、包                     （P＜0.05）；与 PNU-282987 组比较，MLA+PNU-282987
                                                              组大鼠上述指标均显著增加（P＜0.05），且与模型组之
          埋、切片后，取部分切片（剩余部分进行IBA-1阳性表达
                                                              间差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。
          的检测）进行Nissl染色；以95%乙醇脱水，二甲苯透明5
          min，封片；采用光学显微镜观察大鼠海马组织CA1区神                         表1 各组大鼠癫痫发作行为和空间探索实验结果（x±
                                                                   s，n＝15）
          经元的病理学形态。
          2.5 大鼠海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的检测                    组别         癫痫评分/分  癫痫发作持续时间/s 原平台象限停留时间/s 穿过平台次数/次
                                                              对照组           0       0        48.76±5.14  7.26±0.74
              采用 ELISA 法进行检测。每组随机选择 5 只大鼠                     模型组         4.25±0.48 a  146.38±17.36 a  25.19±3.12 a  1.96±0.13 a
          立即断头处死，快速取脑组织并分离两侧海马，用冰生                            PNU-282987组  1.37±0.23 b  80.19±10.12 b  37.23±3.36 b  5.21±0.48 b
          理盐水冲洗表面，称取海马组织质量；用剪刀将海马组                            MLA+PNU-282987组  4.02±0.41 c  140.25±15.23 c  29.33±2.82 c  2.26±0.32 c
          织剪碎，加入 RIPA 裂解液，并使用超声研磨机磨碎，以                           a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与PNU-
          15 000 r/min离心15 min，吸取上清液。严格参照ELISA                282987组比较，P＜0.05。
          试剂盒说明书方法检测大鼠海马组织中TNF-α、IL-6和                        3.2 PNU-282987对TLE模型大鼠认知功能的影响
          IL-1β水平。                                                与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长
          2.6 大鼠海马组织中IBA-1阳性表达细胞的检测                          （P＜0.05），原平台象限停留时间及穿越平台次数均显
              采用免疫荧光染色法进行检测。选取“2.4”项下的                        著减少（P＜0.05）；与模型组比较，PNU-282987 组大鼠
          冰冻切片，室温下放置 30 min，以 PBS 缓冲液洗 3 遍（每                  逃避潜伏期时间显著缩短（P＜0.05），原平台象限停留
          次 5 min），滴加封闭液（5%BSA+0.3%TritonX-100），在             时间及穿越平台次数均显著增加（P＜0.05）；与 PNU-
          37 ℃恒温培养箱中孵育 1 h；甩去多余封闭液，滴加                         282987 组比较，MLA+PNU-282987 组大鼠逃避潜伏期
          IBA-1 一抗（稀释度为 1∶500），于 4 ℃孵育过夜；以 PBS                时间显著延长（P＜0.05），原平台象限停留时间及穿越
          洗涤3次（每次5 min）并吸干液体，滴加Alexa Fluor 594                平台次数均显著减少（P＜0.05），且与模型组之间差异
          标记的二抗（稀释度为 1∶200），室温下孵育 1 h；以 PBS                   无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1、表2。
          避光冲洗 3 次（每次 5 min），滴加 DAPI 复染细胞核后室
                                                              表2 各组大鼠逃避潜伏期的检测结果（x±s，n＝15，s）
          温下避光孵育 10 min，冲洗后用抗荧光淬灭剂封片；采
                                                              组别           第1天    第2天     第3天    第4天    第5天
          用倒置相差荧光显微镜观察并采集图像，通过图像分析                            对照组         40.97±4.37  35.74±3.84  30.64±2.75  21.68±3.11  15.26±1.62
          软件计数每平方毫米中的IBA-1阳性细胞数量。                             模型组         59.38±6.14 a  52.03±6.68 a  45.16±8.39 a  36.09±6.57 a  30.64±4.43 a
          2.7 大鼠海马组织中 α7nAChR/NF-κB 信号通路相关                    PNU-282987组  50.28±4.89 b  42.30±4.17 b  36.13±3.29 b  27.42±2.35 b  20.22±2.71 b
                                                              MLA+PNU-282987组  57.29±5.36 c  51.68±5.01 c  40.81±4.27 c  33.28±3.16 c  28.15±2.54 c
          蛋白表达水平的检测
                                                                 a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与PNU-
              采用 Western blot 法进行检测。每组随机选择 5 只
                                                              282987组比较，P＜0.05。
          大鼠，按“2.5”项下方法收集大鼠海马组织的上清液，按
                                                              3.3 PNU-282987 对 TLE 模型大鼠海马组织 CA1 区神
          BCA法计算上清液中的蛋白浓度；在等量目标蛋白中加
          入缓冲液，煮沸，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶                           经元病理学形态的影响
                                                                  对照组大鼠海马组织细胞质中尼氏小体丰富且神
          电泳，转膜，加入封闭液在4 ℃下封闭过夜；加入α7nAChR、
          NF-κB p65、p-NF-κB p65 一抗（稀释度分别为 1∶500、1∶            经元排列整齐，形态完整。模型组大鼠海马组织细胞质
          1 000、1∶500），于 4 ℃下孵育过夜；以 TBST 缓冲液洗                 中尼氏小体明显减少且神经元排列紊乱，部分细胞水
          膜，加入二抗（稀释度为1∶5 000），常温下孵育50 min；以                   肿，呈现空泡变性坏死，细胞结构不完整。经 PNU-
          TBST 缓冲液洗膜，ECL 发光液显影，成像，使用 Quan‐                    282987处理后，大鼠海马组织细胞质中尼氏小体明显增
          tity One 软件对目的蛋白的灰度值进行分析，并计算目                       多，神经元排列致密，空泡变性坏死减少，损伤程度明显
          的蛋白灰度值与内参蛋白（GAPDH）灰度值的比值，以                          减轻。经 MLA 阻断 α7nAChR 后，PNU-282987 对癫痫
          表示目的蛋白的表达水平。                                        大鼠海马神经元的保护作用被逆转。结果见图1。


          · 2352 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 19                            中国药房  2023年第34卷第19期
   49   50   51   52   53   54   55   56   57   58   59