Page 85 - 《中国药房》2023年17期

鼠灌胃复方地芬诺酯片（8 mg/kg，溶剂为水）建立 STC 55%B；10～22 min，55%B→82%B；22～23 min，82%B→
模型 ，连续灌胃 14 d。每天观察大鼠生活、毛发状态， 99%B；23～24 min，99%B；24～24.1 min，99%B→
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第14天灌胃完成后，将大鼠放入代谢笼中收集其24 h粪 15%B；24.1～27 min，15%B）；流速为 0.3 mL/min；柱温
便，记录粪便数量及质量。若空白组与模型组大鼠24 h 为35 ℃；进样量为2 μL。
粪便数量、质量差异均具有统计学意义则表明造模成 质谱条件：数据采集选用全扫描自动模式，离子源
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+
功 。造模成功后，空白组大鼠继续灌胃水；其余各组大 为电喷雾离子源（ESI），在正（ESI ）、负（ESI ）离子模式
－
鼠均先灌胃复方地芬诺酯片（8 mg/kg），1 h 后模型组大 下扫描，扫描范围为质荷比（m/z）50～1 000。喷雾气压
鼠灌胃水，其余各给药组大鼠灌胃相应药物（以水为溶 力为 55 psi，辅助加热气压力为 55 psi，气帘气压力为 35
剂）；每天灌胃水/药物1次，连续1周。实验期间让大鼠 psi；温度为500 ℃；离子化电压为±4 500 V，去簇电压为
自由饮食、摄水，每周记录其体重。 50 eV（ESI）、－60 eV（ESI ） eV；TOF-MS模式下设置碰
－
+
2.2.2 生物样本收集及处理 撞电压为±10 eV；IDA-MS/MS 条件下设置碰撞电压为
末次灌胃后将大鼠放入代谢笼，第 2 天收集其 24 h ±35 eV，碰撞电压差为±15 eV。
尿液、粪便，分装放置于－80 ℃冰箱中储存备用。收集 2.2.6 数据处理
尿液和粪便后，空白组大鼠灌胃水；模型组大鼠灌胃复 将采集所得代谢组学质谱原始数据通过 Analysis
方地芬诺酯片；给药组大鼠先灌胃复方地芬诺酯片，1 h Base File Converter软件转化为.abf格式的文件，随后通
后灌胃相应药物。30 min后采集各组大鼠眼眶血，将血 过MS-DAIL3.9软件以及SEERF平台（https：//slfan2013.
样于室温下放置 1 h，以 3 500 r/min 离心 10 min，取上清 github.io/SERRF-online/）进行色谱峰对齐、峰过滤、归一
液，再在4 ℃下以14 000 r/min离心10 min，收集上清液， 化预处理，然后将数据导入 SIMCA 14.1 软件进行偏最
分装，在－80 ℃冰箱中储存备用。 小二乘-判别分析（partial least squares discriminant analy‐
2.2.3 血清样品的制备 sis，PLS-DA）以及正交偏最小二乘-判别分析（orthogo‐
取－80 ℃冰箱中冻存的血清样本，室温解冻。取 nal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），
200 µL 解冻后的血清样本于 2 mL 离心管中，加入 600 根据各样本聚集情况筛选离群样本。将筛选后的各组
µL 乙腈，涡旋 60 s，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10
数据导入 MetaboAnalyst 5.0 在线软件，当 2 组代谢物差
min，取上清液，转移至 2 mL 离心管中，室温下氮吹至
异倍数（fold change，FC）＞1.2且P＜0.05或FC＜0.833 3
干。残渣加入100 µL乙腈复溶，于4 ℃下以12 000 r/min
且 P＜0.05 时，提示该代谢物可能为潜在的差异代谢
离心 10 min，取上清液，待测。取上述 39 只大鼠血清样
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物 。结合人类代谢组数据库（HMDB，https：//hmdb.
本各40 μL于10 mL离心管中混合，加入4 680 µL乙腈，
ca），将已鉴定的内源性差异代谢物利用 MetaboAnalyst
按血清样品的处理方式处理，室温下氮吹至干。残渣加
5.0软件进行富集分析以及相关代谢通路分析。
入780 µL乙腈复溶，于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，
2.3 统计学方法
取上清液，得到质量控制（quality control，QC）样本。
采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析。实验结果以
2.2.4 尿液样品的制备
x±s 表示，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检验水准
取－80 ℃冰箱中的尿液样本，室温解冻。取 400
α＝0.05。
µL 解冻的尿液样本于 2 mL 离心管中，加入 1 200 µL 乙
3 结果
腈，涡旋60 s，于4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，取上
3.1 小鼠药效学实验结果
清液，转移至 2 mL 离心管中，室温下氮吹至干；残渣加
3.1.1 小鼠肠推进实验结果
入 300 µL 乙腈复溶，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10
与空白组比较，模型组小鼠墨汁推进率显著降低
min，取上清液，待测。取上述 39 只大鼠尿液样本各 50
（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和快松饮高剂量
μL 于 10 mL 离心管中混合，加入 5 850 µL 乙腈，按上述
组小鼠墨汁推进率显著升高（P＜0.05）。结果见表1。
尿液样品处理方式处理，室温下氮吹至干；残渣加入
1 463 µL 乙腈复溶，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 10 表 1 各组小鼠的肠推进实验结果（x±s，n＝10）
min，取上清液，得到QC样本。 组别 小肠总长度/cm 墨汁推进长度/cm 墨汁推进率/%
空白组 56.6±5.3 50.8±4.7 89.9±5.6
2.2.5 色谱与质谱条件 模型组 55.0±2.9 46.8±3.8 85.0±3.9 a
色谱条件：采用 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱 阳性对照组 56.3±2.7 51.8±5.2 92.0±7.7 b
快松饮低剂量组 55.7±2.6 49.4±5.7 88.5±7.5
（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以 0.05% 甲酸溶液（A）-乙
快松饮中剂量组 58.8±1.6 52.4±4.8 89.1±7.7
腈（B）为 流 动 相 进 行 梯 度 洗 脱（0～2 min，15%B→ 快松饮高剂量组 60.4±4.4 54.8±3.6 91.0±6.3 b
18%B；2～7 min，18%B→35%B；7～10 min，35%B→ a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05。

中国药房 2023年第34卷第17期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 17 · 2123 ·