Page 43 - 《中国药房》2023年16期
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液（PBS）洗涤后，使用显微镜观察其克隆形成情况并计                         mg/kg 的 SC79；裸鼠 NC 组裸鼠灌胃并腹腔注射等体积
          算克隆形成率：细胞克隆形成率＝平均细胞克隆数/每孔                          生理盐水，每天 1 次，连续 28 d。末次给药 24 h 后，以颈
          接种细胞总数×100%。                                       椎脱臼处死各组裸鼠，切除瘤体并称定质量，以游标卡
                                                                                                         3
          2.1.4 细胞凋亡检测                                       尺测量并计算瘤体体积：瘤体体积＝[0.5×（a+b）]（式
              采用流式细胞术进行检测。取对数生长期细胞，按                         中，a、b分别为肿瘤的长径、短径）。
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          1×10 个/孔接种于 6 孔板中，按照“2.1.1”项下方法分组                  2.3 统计学方法
         （每组设置6个复孔）、处理。收集各组细胞，用PBS洗涤                             使用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。数据以
          后，按 Annexin Ⅴ-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书                 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两
          方法进行染色，于37 ℃下避光孵育30 min后，采用流式                      两比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          细胞仪检测细胞凋亡率。                                        3 结果
          2.1.5 细胞中增殖/凋亡相关蛋白和 Akt/MAPK 信号通                   3.1 体外细胞实验结果
          路相关蛋白表达检测                                          3.1.1 SM对细胞增殖和克隆形成能力的影响
              采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期细                      与 NC 组比较，SM-L 组、SM-M 组、SM-H 组细胞的
          胞，按1×10 个/孔接种于96孔板中，按照“2.1.1”项下方                   OD 值、克隆形成率均显著降低且有浓度依赖性（P＜
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          法分组（每组设置 6 个复孔）、处理。收集各组细胞，用                        0.05），SC79 组细胞的 OD 值、克隆形成率均显著升高
          RIPA裂解液裂解以提取总蛋白。蛋白经定量、电泳、转                        （P＜0.05）；与 SM-H 组比较，SM-H+SC79 组细胞的 OD
          膜、封闭后，加入增殖/凋亡相关蛋白（PCNA、Bax、Bcl-2、                  值、克隆形成率均显著升高（P＜0.05）。结果见表 1、
          caspase-3）、Akt/MAPK 信号通路相关蛋白（Akt、p-Akt、            图1。

          p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2）、内参蛋           表1 各组细胞 OD 值、克隆形成率、凋亡率比较（x±s，
          白（β-actin）的一抗（稀释比例分别为 1∶1 000、1∶2 000、                  n＝6）
          1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、1∶2 000、    组别           OD值         克隆形成率/%       凋亡率/%
                                                              NC组         0.83±0.06    57.78±2.36   25.56±1.28
          1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000），于4 ℃下孵育过夜；洗膜后，
                                                              SM-L组       0.71±0.05 a  50.33±2.17 a  32.28±1.61 a
          加入相应二抗（稀释比例为 1∶2 000），于室温下孵育 1.5                    SM-M组       0.62±0.04 ab  41.42±2.05 ab  40.46±2.28 ab
          h；再次洗膜后，加入 ECL 试剂显色并使用凝胶成像系                         SM-H组       0.41±0.03 abc  28.35±1.43 abc  51.52±2.35 abc
                                                              SC79组       0.98±0.08 a  67.76±3.08 a  14.77±0.69 a
          统成像。使用 Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以
                                                              SM-H+SC79组  0.66±0.07 d  42.43±2.26 d  33.65±1.78 d
          PCNA、Bax、Bcl-2、caspase-3 与内参蛋白的灰度值比值
                                                                a：与NC组比较，P＜0.05；b：与SM-L组比较，P＜0.05；c：与SM-M
          表 示 上 述 蛋 白 的 表 达 水 平 ，以 p-Akt 与 Akt、p-p38         组比较，P＜0.05；d：与SM-H组比较，P＜0.05。
          MAPK 与 p38 MAPK、p-ERK1/2 与 ERK1/2 的灰度值比            3.1.2 SM对细胞凋亡的影响
          值分别表示 Akt、p38 MAPK、ERK1/2 蛋白的磷酸化                       与 NC 组比较，SM-L 组、SM-M 组、SM-H 组细胞的
          水平。                                                凋亡率均显著升高且有浓度依赖性（P＜0.05），SC79 组
          2.2 体内异种移植瘤实验                                      细胞的凋亡率显著降低（P＜0.05）；与 SM-H 组比较，
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              取U87细胞悬液（200 μL含细胞1×10 个），皮下注                  SM-H+SC79组细胞的凋亡率显著降低（P＜0.05）。结果
          射至BALB/c裸鼠的右侧腋窝内，当移植瘤体可触及（约                        见表1、图2。
          接种后7 d）时，将裸鼠随机分为对照组（裸鼠NC组）、低                       3.1.3 SM对细胞中增殖/凋亡相关蛋白表达的影响
          剂量 SM 组（裸鼠 SM-L 组）、中剂量 SM 组（裸鼠 SM-M                    与 NC 组比较，SM-L 组、SM-M 组、SM-H 组细胞中
          组）、高剂量 SM 组（裸鼠 SM-H 组）、Akt 激活剂组（裸鼠                 PCNA、Bcl-2蛋白的表达水平均显著降低，Bax、caspase-

          SC79 组）、高剂量 SM 联合 Akt 激活剂组（裸鼠 SM-H+                3 蛋白的表达水平均显著升高，且均有浓度依赖性（P＜
          SC79组），每组5只。参考相关文献            [9，11] 及前期预实验结       0.05）；SC79组细胞中PCNA、Bcl-2蛋白的表达水平均显
          果设置各药物组剂量：裸鼠 SM-L 组、裸鼠 SM-M 组、裸                    著升高，Bax、caspase-3 蛋白的表达水平均显著降低
          鼠 SM-H 组裸鼠分别灌胃 25、50、100 mg/kg 的 SM，同时            （P＜0.05）。与 SM-H 组比较，SM-H+SC79 组细胞中
          腹腔注射等体积生理盐水；裸鼠 SC79 组裸鼠腹腔注射                        PCNA、Bcl-2 蛋白的表达水平均显著升高，Bax、cas‐
          40 mg/kg 的 SC79，同时灌胃等体积生理盐水；裸鼠 SM-                 pase-3 蛋白的表达水平均显著降低（P＜0.05）。结果见
          H+SC79 组裸鼠灌胃 100 mg/kg 的 SM，同时腹腔注射 40              图3、表2。


          中国药房  2023年第34卷第16期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 16    · 1957 ·
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