Page 42 - 《中国药房》2023年16期
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胶质瘤是成人中枢神经系统常见的恶性原发性脑                          （p-ERK1/2）、β-肌动蛋白（β-actin）一抗和辣根过氧化物
              [1]
          肿瘤 。神经胶质瘤是胶质瘤的常见类型之一，具有侵                            酶（HRP）标记的羊抗兔 IgG 二抗（批号分别为 ab29、
          袭性，且患者预后不佳 。由于大脑中枢神经系统结构                            ab32124、ab32503、ab32351、ab8805、ab170099、ab184699、
                              [2]
          的特殊性（如存在血脑屏障），使得药物研发面临诸多挑                           ab38449、ab178867、ab278538、ab8245、ab6721）均购自英
            [2]
          战 。尽管研究者在肿瘤诊断方式和治疗策略方面取得                            国Abcam公司；DMEM培养基（批号MED-1001）购自武
                                                        [3]
          了新的进展，但神经胶质瘤患者的病死率仍然很高 。                            汉赛奥斯生物科技有限公司。
          因此，寻找更有效的神经胶质瘤治疗手段十分必要。                             1.3 细胞与动物
              水飞蓟素（silymarin，SM）是一种多酚类黄酮，具有                       人神经胶质瘤细胞系U87（批号CL-0238）购自武汉
                                    [4]
          抗氧化、抗癌等多种生物活性 。据报道，SM 可抑制非                          益普生物科技有限公司。
                                          [5]
          小细胞肺癌细胞的增殖，促进其凋亡 ；同时，其可抑制                               SPF 级雄性 BALB/c 裸鼠（30 只，5 周龄，体重约 20
                                              [6]
          胶质瘤皮下移植模型裸鼠体内肿瘤的生长 。以上研究                            g）购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证
          均表明，SM具有一定的抗癌活性。相关研究显示，抑制                           号为 SCXK（湘）2019-0017。所有裸鼠均饲养于温度
          蛋白激酶B（protein kinase B，又称Akt）/促分裂原活化的              （23±3）℃、相对湿度（40±10）%、12 h 光照/12 h 黑暗交
          蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号
                                                              替的动物房内，自由摄食、饮水。本动物实验方案获得
                                                        [7]
          通路可抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭 ；
                                                              河北北方学院附属第一医院医学伦理委员会审核通过
          SM 可通过 MAPK 信号通路来促进人肺腺癌 A549 细胞
                                                             （批件号W2022013）。
          的凋亡 。可见，Akt/MAPK信号通路可能是SM调控神
                [8]
                                                              2 方法
          经胶质瘤等肿瘤细胞增殖、凋亡的潜在途径之一。基于
                                                              2.1 体外细胞实验
          此，本研究拟探讨SM对人神经胶质瘤细胞增殖、凋亡及
                                                              2.1.1 细胞培养与分组
          裸鼠体内移植瘤生长的影响，并通过Akt/MAPK信号通
                                                                  将U87细胞接种于含10%胎牛血清、1%青霉素-链
          路探究其潜在作用机制，为神经胶质瘤的临床治疗提供
                                                              霉素的 DMEM 培养基中，于 37 ℃、5%CO2条件下培养，
          参考。
                                                              每3 d更换1次培养基。取对数生长期细胞，随机分为对
          1 材料
                                                              照组（NC组）、低质量浓度SM组（SM-L组）、中质量浓度
          1.1 主要仪器
                                                              SM 组（SM-M 组）、高质量浓度 SM 组（SM-H 组）、Akt 激
              本研究所用主要仪器包括BPN-50CH型CO2培养箱
                                                              活剂组（SC79 组）、高质量浓度 SM 联合 Akt 激活剂组
         （上海五久自动化设备有限公司）、ST-360 型酶标仪（上
                                                             （SM-H+SC79 组）。参考相关文献          [9―10] 及前期预实验结
          海科华实验系统有限公司）、FACS Calibur型流式细胞仪
                                                              果设置各药物组质量浓度：SM-L 组、SM-M 组、SM-H
         （美国 Beckman Coulter 公司）、DYCZ-MINI 4 型四板垂
                                                              组、SC79 组细胞分别用 50、100、200 μg/mL 的 SM 和 20
          直电泳仪（北京六一仪器有限公司）、CX33型显微镜（日
                                                              μmol/L 的 SC79 处理 48 h；SM-H+SC79 组细胞用 200
          本 Olympus 公司）、EC3 型凝胶成像系统（美国 UVP 公
                                                              μg/mL的SM和20 μmol/L的SC79共同处理48 h；NC组
          司）等。
          1.2 主要试剂                                            细胞不经任何药物处理，正常培养48 h。
              SM 对照品（批号 XKB0213，纯度≥98%）购自上海                   2.1.2 细胞增殖检测
          晅科生物科技有限公司；SC79对照品（Akt激活剂，批号                            采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期细胞，按
                                                                   4
          HY-18749，纯度≥98%）购自美国 MCE 公司；CCK-8 试                 1×10 个/孔接种于 96 孔板中，按照“2.1.1”项下方法分
          剂盒（批号 CK04）购自深圳市纽邦生物科技有限公司；                         组（每组设置 6 个复孔）、处理。随后，每孔加入 CCK-8
          Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（批号CA001）                 试剂10 μL，于37 ℃下孵育1 h，采用酶标仪于450 nm波
          购自南京莱富赛生物科技有限公司；兔源增殖细胞核抗                            长处检测各孔的光密度（OD）值，用以反映细胞的增殖
          原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、B细胞淋巴    能力。
          瘤 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-     2.1.3 细胞克隆形成能力检测
          2-associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶 3（caspase-3）、         采用克隆形成实验进行检测。取对数生长期细胞，
          Akt、p38 MAPK、胞外信号调节激酶 1/2（extracellular             按 600 个/孔接种于 6 孔板中，按照“2.1.1”项下方法分组
          signal-regulated  kinase  1/2，ERK1/2）、磷 酸 化 Akt（p-  （每组设置 6 个复孔）、处理后，培养 14 d。收集各组细
          Akt）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）、磷酸化ERK1/2              胞，用甲醇固定，再以 0.1% 结晶紫染色，用磷酸盐缓冲


          · 1956 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 16                            中国药房  2023年第34卷第16期
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