Page 82 - 《中国药房》2023年15期
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研究热点。小檗碱（berberine，BER）是一种从黄连中分                     抗（批号分别为 15014、15015、67733-1-Ig）均购自美国
          离出来的生物碱，是传统中药黄连的主要有效成分，可                            Proteintech公司。
          用于治疗许多疾病，如消化、代谢、心血管和神经系统疾                           1.3 细胞株
          病以及肿瘤 。有研究指出，在 RCC 中，BER 可通过调                           人肾癌OSRC-2细胞株购自中国科学院上海生命科
                    [2]
          控基质金属蛋白酶 2（matrix metallopeptidase 2，MMP2）          学研究院细胞资源中心。
                               [3]
          的表达发挥抗肿瘤作用 。最近的一项研究表明，在光                            2 方法
          动力疗法中 BER 可作为一种光敏剂抑制 RCC 发展 。                       2.1 细胞培养
                                                        [4]
          目前国内外关于BER抑制肾癌细胞侵袭、迁移的机制研                               OSRC-2 细胞采用含 10%FBS 的 DMEM 培养基培
          究鲜有报道，需要更多的研究证实。                                    养，培养箱条件设定为37 ℃、5%CO2，常规培养与传代。
              甲 基 转 移 酶 样 蛋 白 3（methyltransferase-like  3，    选取对数生长期的细胞进行后续实验。
          METTL3）是 N6- 甲 基 腺 嘌 呤（N6-methyladenosine，          2.2 BER对细胞增殖的影响
          m6A）修 饰 过 程 中 的 一 个 关 键 分 子 。 研 究 显 示 ，                 采用 alamarBlue 法进行测定。取对数生长期的
                                                     [5]
          METTL3在多种实体瘤中常明显扩增，例如结肠癌 、前                         OSRC-2 细胞，采用含 10%FBS 的 DMEM 培养基常规培
                [6]
          列腺癌 等，因此METTL3是一种原癌基因。在RCC中                         养，调整细胞密度为 3×10 个/mL，按 100 μL/孔接种到
                                                                                     3
          METTL3的表达明显高于正常组织，并且METTL3低表                        96 孔板内。将细胞分为对照组（0 μmol/L）和不同浓度
                                                     [7]
          达患者的总生存期明显长于METTL3高表达患者 。可                         （25、50、75、100、125、150、175、200 μmol/L，浓度依据前
          见，METTL3 可能是 BER 抗 RCC 的一个重要靶点。鉴                    期预实验结果设置）的BER组，每组设置6个复孔；另设

          于此，本研究通过体外培养人肾癌 OSRC-2 细胞，探索                        空白对照组（不加细胞和药物，只加培养基）。分别干预
          BER 对 OSRC-2 细胞增殖、周期、迁移和侵袭的影响，并                     24、48 h后，每孔加入10 μL alamarBlue试剂，在37 ℃下
          探讨 BER 对 METTL3 表达的调控作用，分析其抗 RCC                    孵育2 h后用酶标仪测定各孔的光密度（optical density，
          的可能机制，为其后续研究提供理论支持。                                 OD）值，其激发光波长为560 nm、发射光波长为590 nm。
          1 材料                                                计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率（%）＝[1－（实验
          1.1 主要仪器                                            组OD值－空白对照组OD值）/（对照组OD值－空白对
              本研究所用的主要仪器有A2型生物安全柜、Multi‐                      照组OD值）]×100%。实验重复3次。
              TM
          skan FC型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、          2.3 BER对细胞周期的影响
          Centrifuge 5418 R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公                  采用流式细胞术进行检测。取对数生长期细胞，将
                      TM
          司）、PowerPac Basic型电泳仪、Chemidoc Tonch型化学             细胞以 2×10 个/孔的密度接种于 6 孔板中，常规培养。
                                                                         5
          发光显影仪（美国Bio-Rad公司）、CKX41-A32PH型倒置                   待细胞稳定后分为对照组（0 μmol/L）和不同浓度（50、
          显微镜（日本Olympus公司）。                                   100 μmol/L，浓度根据“2.2”项下实验结果设置）BER组，
          1.2 主要药品与试剂                                         每组设置 3 个复孔。BER 干预 48 h 后，以 1 000 r/min 离
              小檗碱对照品（批号8818，纯度≥98%）购自上海诗                      心 4 min，收集细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，
          丹德生物技术有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 培养                        加入500 μL预冷的70%乙醇，于4 ℃固定过夜。再次以
          基、鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批号分别为                     1 000 r/min 离心 4 min 去除乙醇，并用预冷的 PBS 洗涤
          MFBS2206X、MSDM2207X、MAN1001）均购自上海迈                  细胞，加入 500 μL 含 100 μg/mL RNase A 的 PBS，37 ℃
          基生物技术有限公司；m6A 甲基化定量试剂盒（批号 P-                        水浴 30 min，继续加入 50 μg/mL 碘化丙啶（PI），4 ℃避

          9008）购自美国 Epigentek 公司；胰蛋白酶、蛋白裂解液、                  光30 min，以标准程序用流式细胞仪测定各组细胞的细
          BCA 蛋白浓度定量试剂盒（批号分别为 030723220323、                   胞周期占比。实验重复3次。
          101722221111、092822221104）均购自上海碧云天生物                2.4 BER对细胞迁移能力的影响
          技 术 有 限 公 司 ；超 敏 ECL 化 学 发 光 试 剂 盒（批 号                  采用划痕实验进行检测。取对数生长期细胞，将细
                                                                       5
          2227601）购自美国 Millipore 公司；蛋白预染 Marker（批             胞以4×10 个/孔的密度接种到6孔板内，常规培养至细
          号 2590111）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；兔        胞基本融合至 90%。用 200 μL 无菌移液器枪头垂直于
          抗人METTL3单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记                        细胞上划出细痕，每孔3条。PBS缓慢洗2遍，去除划除
          羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记羊抗兔IgG二                       的细胞。按“2.3”项下方法分组及给药，每组设置3个复


          · 1864 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 15                            中国药房  2023年第34卷第15期
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