Page 41 - 《中国药房》2023年14期
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伊红（HE）染色和免疫组化实验；另一部分（含每组另 6                        度 1∶2 000），在室温下孵育 2 h；以 ECL 显色后，于凝胶
          只大鼠的下腔静脉组织）保存于－80 ℃冰箱中，用于                          成像分析系统下成像。分别以β-actin（对应SIRT2）为内
          ELISA、Western blot检测。                              参，以 NF-κB p65[对应 p-NF-κB p65、NF-κB p65（acetyl
          2.3 大鼠凝血功能指标的检测                                    K310）]为参照，采用Image J软件分析SIRT2蛋白的表达
              取“2.2”项下各组大鼠血样适量，经抗凝处理后得血                      水平和NF-κB p65蛋白的磷酸化、乙酰化水平。
          浆样品，使用全自动凝血分析仪检测其活化部分凝血活                           2.8 统计学方法
          酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝      使用SPSS 15.0软件对数据进行统计分析。符合正
          血酶时间（thrombin time，TT）、凝血酶原时间（prothrom‐            态分布且方差齐的数据以x±s表示，多组间比较采用单
          bin time，PT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）。                因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。检验
          2.4 大鼠血清和下腔静脉组织中炎症指标的检测                            水准α＝0.05。
              采用 ELISA 法进行检测。取“2.2”项下各组大鼠血                   3 结果
          样适量，于 4 ℃下以 10 000 r/min 离心 15 min，收集上层            3.1 HXD对各组大鼠凝血功能指标的影响
          血清，严格按照试剂盒说明书操作，以酶标仪检测血清                               与 CK 组比较，Model 组大鼠的 APTT、TT、PT 均显
          中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。取“2.2”项下冻存的各组大                 著缩短，FIB含量显著升高（P＜0.05）；与Model组比较，
          鼠下腔静脉组织适量，研磨得组织匀浆，以10 000 r/min                    HXD-L 组、HXD-M 组、HXD-H 组、LMWHS 组大鼠的
          离心20 min，收集上清液，严格按照试剂盒说明书操作，                       APTT、TT、PT 均显著延长，FIB 含量均显著降低，AK-7
          以酶标仪检测匀浆上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。                    组大鼠上述指标的变化趋势与之相反（P＜0.05）；与
          2.5 大鼠下腔静脉血栓形成的观察                                  HXD-L 组比较，HXD-M 组、HXD-H 组、LMWHS 组大鼠
              采用HE染色法进行观察。取“2.2”项下固定（24 h）                   的APTT、TT、PT均显著延长，FIB含量均显著降低（P＜
          于4%多聚甲醛中的各组大鼠下腔静脉组织适量，洗涤，
                                                             0.05）；与 HXD-M 组 比 较 ，HXD-M+AK-7 组 大 鼠 的
          常规石蜡包埋后切片（厚度 5 μm），经 HE 染色后，使用                     APTT、TT、PT 均 显 著 缩 短 ，FIB 含 量 显 著 升 高（P＜
          光学显微镜观察其下腔静脉组织的病理变化。观察后，
                                                             0.05）。结果见表1。
          取出大鼠血栓并立即称重，得血栓湿重；用滤纸吸干其
                                                             表1 HXD对各组大鼠凝血功能指标的影响（x±s，n＝
          表面液体，于60 ℃下干燥2 h后再次称重，得血栓干重。                            12）
          2.6 大鼠下腔静脉组织中TF蛋白表达的检测
                                                              组别         APTT/s     TT/s      PT/s    FIB/（g/L）
              采用免疫组化染色法进行检测。取“2.5”项下各组                        CK组       18.25±0.83  35.56±1.62  12.28±0.55  2.21±0.14
                                                              Model组    14.15±0.68 a  28.84±1.35 a  8.26±0.34 a  5.35±0.22 a
          大鼠的病理切片，经脱蜡、水化后，置于 3% 过氧化氢中
                                                              HXD-L组    15.72±0.61 b  30.36±1.44 b  9.39±0.41 b  4.01±0.24 b
          并加入柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，再加入 TF 一抗                          HXD-M组    17.83±0.81 bc  34.42±1.56 bc  11.72±0.43 bc  2.82±0.13 bc
         （稀释度1∶2 000），在4 ℃下孵育过夜；再加入相应二抗                       HXD-H组    17.86±0.80 bc  34.45±1.54 bc  11.74±0.45 bc  2.81±0.12 bc
                                                              LMWHS组    17.87±0.83 bc  34.51±1.58 bc  11.76±0.42 bc  2.85±0.10 bc
         （稀释度 1∶2 000），共同孵育 1.5 h；经二氨基联苯胺显
                                                              AK-7组     12.32±0.42 b  24.45±1.05 b  7.05±0.22 b  7.07±0.29 b
          色、苏木精复染后，使用光学显微镜观察下腔静脉组织                            HXD-M+AK-7组  15.86±0.64 d  31.22±1.36 d  9.75±0.36 d  3.77±0.15 d
          中 TF 蛋白的表达情况，并按如下标准进行评分——染                            a：与CK组比较，P＜0.05；b：与Model组比较，P＜0.05；c：与HXD-L
          色程度：未染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕                         组比较，P＜0.05；d：与HXD-M组比较，P＜0.05。
          褐黄色为3分；染色面积占比：≤5%为0分，6%～25%为                       3.2 HXD对各组大鼠血清和下腔静脉组织中炎症指标
          1 分，26%～50% 为 2 分，51%～75% 为 3 分，＞75% 为 4           的影响
          分；上述 2 项评分的乘积≤3 分代表染色不明显，＞3 分                          与 CK 组比较，Model 组大鼠血清和下腔静脉组织
                      [11]
          代表染色明显 。                                           中 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均显著升高（P＜0.05）；与
          2.7 大鼠下腔静脉组织中SIRT2/NF-κκB通路相关蛋白                    Model 组 比 较 ，HXD-L 组 、HXD-M 组 、HXD-H 组 、
          表达的检测                                              LMWHS 组大鼠血清和下腔静脉组织中 IL-1β、IL-6、
              采用 Western blot 法进行检测。取“2.2”项下冻存               TNF-α 水平均显著降低，AK-7 组大鼠上述指标的变化
          的各组大鼠下腔静脉组织适量，用放射免疫沉淀法裂                            趋势与之相反（P＜0.05）；与HXD-L组比较，HXD-M组、
          解并提取其总蛋白。总蛋白经定量、电泳、转膜、封闭                           HXD-H 组、LMWHS 组大鼠血清和下腔静脉组织中 IL-
          后，与一抗 SIRT2（稀释度 1∶2 000）、p-NF-κB p65（稀释            1β、IL-6、TNF-α 水平均显著降低（P＜0.05）；与 HXD-M
          度1∶2 000）、NF-κB p65（acetyl K310）（稀释度1∶2 000）、      组比较，HXD-M+AK-7 组大鼠血清和下腔静脉组织中
          NF-κB p65（稀释度 1∶2 000）、β-actin（稀释度 1∶1 000）        IL-1β、IL-6、TNF-α 水平均显著升高（P＜0.05）。结果
          混合并在 4 ℃下孵育过夜；随后，加入相应二抗（稀释                         见表2。


          中国药房  2023年第34卷第14期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 14    · 1699 ·
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