Page 14 - 《中国药房》2023年12期

近年来，乳腺癌的发病率持续上升，已成为世界第 购自北京索莱宝科技有限公司；吖啶橙（acridine orange，
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一大癌 。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer， AO）/溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色试剂盒（批号
TNBC）是雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受 E607308-0200）购自生工生物工程（上海）股份有限公
体（progesterone receptor，PR）和人表皮生长因子受体 2 司；鼠源 B 细胞淋巴瘤 2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）抗
（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）均呈 体，兔源磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、Bcl-2相关X蛋白
阴性表达的乳腺癌亚型，在所有乳腺癌病理类型中占 （Bcl-2-associated X protein，Bax）、胱 天 蛋 白 酶 3（cas‐
12%～20%，具有发病年龄小、复发率和远端转移率高的 pase-3）、细胞色素 C（cytochrome C，Cyt-C）、活化的 cas‐
特点，为高侵袭性乳腺癌亚型 [2―3] 。由于临床治疗缺乏 pase-9（cleaved caspase-9）抗体和辣根过氧化物酶标记的
靶向性，常规内分泌治疗效果欠佳，故 TNBC 的治疗难 山羊抗兔、山羊抗小鼠免疫球蛋白 G 二抗（批号分别为
度大，患者的生存率较低 [4―6] 。因此，发现有效抑制 15071S、5174S、5023S、9662S、4280T、7237T、7074S、
TNBC复发转移的药物、降低患者病死率成为临床亟待 7076P2）均购自美国 Cell Signaling 公司；兔源 caspase-9
解决的问题。 抗体（批号 10380-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公
中药抗肿瘤具有悠久的历史，狼毒大戟 Euphorbia 司；兔源cleaved caspase-3抗体（批号N09021992）购自沈
fischeriana Steud.是我国东北地区的传统多年生草本植 阳万类生物科技有限公司；ECL 发光试剂盒（批号
物，为中药狼毒的基原植物，可用于水肿、腹水、肺结核 CW0049）购自北京康为世纪生物科技股份有限公司；其
和癌症的治疗 [7―8] 。相关基础研究证实，该药材中的狼 余试剂均为分析纯，水为超纯水。
毒素、狼毒素 A、狼毒素 C 等成分可诱导 TNBC 细胞 1.3 细胞
MDA-MB-231凋亡并抑制其增殖，且以狼毒素A的抑制 人TNBC细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468均购
作用最强 [9―10] 。研究指出，二萜类化合物是狼毒大戟的 自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
[11]
主要活性成分 ，其中17-羟-岩大戟内酯B（17-hydroxy- 2 方法
jolkinolide B，HJB）对人肝癌HepG 2细胞、乳腺癌MCF- 2.1 细胞培养
7 细胞、胃癌 SGC-7901 细胞、胃癌 MGC-803 细胞、宫颈 MDA-MB-231、MDA-MB-468细胞均接种于含10%
癌HeLa细胞、TNBC细胞等多种肿瘤细胞均具有较好的 胎牛血清、100 μg/mL 青霉素-链霉素的 L-15 培养基中，
抑制作用，并可通过启动线粒体途径来诱导人胶质瘤 于 37 ℃、无 CO2的条件下培养（后续培养条件相同），并
U251细胞凋亡 [12―13] ，但对TNBC细胞的作用机制尚不明 于细胞融合至85%左右进行传代。本研究选用传至6～
确。基于此，本研究以人 TNBC 细胞为对象，观察 HJB 10代的细胞进行后续实验。
对该细胞增殖和凋亡的影响，并初步探讨其发挥抗癌作 2.2 细胞增殖抑制率的检测
用的相关机制，旨在为优化 TNBC 的临床治疗提供依 采用 MTT 法进行检测。取处于对数生长期的
据，为进一步挖掘传统中药狼毒抗肿瘤作用的物质基础 MDA-MB-231、MDA-MB-468 细胞，按 1×10 个/孔接种
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及具体机制提供参考。 于96孔板。待细胞贴壁后，将其分为空白对照组（不加
1 材料 药干预，即HJB 0 μmol/L）和不同浓度HJB组（5、10、20、
1.1 主要仪器 40、80 μmol/L，药物浓度根据前期预实验结果设置），每
本研究所用主要仪器包括 311 型 CO2恒温培养箱 组设置 3 个复孔。分别于培养 24、48、72 h 时，避光加入
（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），Axio Observer A1 5 mg/mL 的 MTT 溶液，继续培养 4 h，弃去培养液，每孔
型倒置显微镜、LSM710 型激光共聚焦显微镜（德国 加入二甲基亚砜 150 μL，充分振荡，使用酶标仪于 490
Zeiss公司），Safire2型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）， nm 波长下检测各孔的光密度（OD）值并计算细胞的增
Power/PAC3000 型电泳仪、ChemiDoc MP 型凝胶成像仪 殖抑制率。增殖抑制率（%）＝（1－实验组 OD 值/空白
（美国Bio-Rad公司），FACS Calibur型流式细胞仪（美国 对照组 OD 值）×100%。用 SPSS 25.0 软件计算 HJB 作
BD公司）等。 用于 2 种细胞 24 h 的半数抑制浓度（median inhibitory
1.2 主要药品与试剂 concentration，IC50 ）值。
HJB原料药（纯度＞98%）由齐齐哈尔医学院医药科 2.3 细胞凋亡情况检测
学研究院提供；L-15培养基（批号PYG0038）购自武汉博 2.3.1 细胞凋亡形态 采用AO/EB双染色法进行观察。
士德生物工程有限公司；活性氧检测试剂盒、细胞凋亡 取处于对数生长期的 MDA-MB-231、MDA-MB-468 细
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线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、细胞凋亡检测试剂盒 胞，按1×10 个/孔接种于6孔激光共聚焦培养板。待细
（批号分别为 KGT0101-1、KGA601、KGA101）均购自江 胞贴壁后，将其分为空白对照组（不加药物干预，即HJB
苏凯基生物技术股份有限公司；MTT试剂（批号M8180） 0 μmol/L）和不同浓度HJB组（10、20、40 μmol/L，药物浓

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