Page 15 - 《中国药房》2023年12期

度根据本课题组前期预实验和“2.2”项下MTT实验结果 2.6 细胞凋亡相关蛋白表达情况检测
设置，下同），每组设置3个复孔。培养24 h后，细胞用磷 采用 Western blot 法进行检测。取处于对数生长期
酸盐缓冲液洗涤2次，加入AO、EB染液各5 μL，轻柔混 的 MDA-MB-231、MDA-MB-468 细胞，按 2×10 个/皿接
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匀，于室温下避光孵育5 min，使用激光共聚焦显微镜观 种于培养皿（直径 100 mm）。待细胞贴壁后，按“2.3.1”
察各组细胞的凋亡形态并拍照。 项下方法分组给药。培养24 h，细胞用含蛋白酶抑制剂
2.3.2 细胞总凋亡率 采用流式细胞术进行检测。取 的裂解液于冰上裂解，每 5 min 振荡 1 次；裂解 30 min
处于对数生长期的 MDA-MB-231、MDA-MB-468 细胞， 后，于 4 ℃下以 12 000 r/min 离心 25 min，收集蛋白上清
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按1×10 个/孔接种于6孔板。待细胞贴壁后，按“2.3.1” 液，以 BCA 法测定浓度后进行变性处理。取变性后的
项下方法分组给药。培养24 h后，细胞用不含乙二胺四 蛋白适量，经凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜
乙酸的胰酶消化，以 2 000 r/min 离心 5 min，弃去上清 上，用牛血清白蛋白封闭液封闭 2 h；加入 Bcl-2、Bax、
液；细胞用磷酸盐缓冲液洗涤2次，弃去上清液；细胞用 Cyt-C、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9、cleaved
binding buffer 500 μL 重悬，依次加入 Annexin Ⅴ-FITC、 caspase-9、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵
PI染液各5 μL，混匀，室温避光孵育10 min，使用流式细
育过夜；洗膜，加入相应二抗（稀释比例均为 1∶2 000），
胞仪检测各组细胞的总凋亡率。
室温孵育1.5 h；洗膜，用ECL发光试剂显影后，于凝胶成
2.4 细胞线粒体膜电位检测
像仪下成像，采用Image J 软件分析条带灰度值，并计算
2.4.1 细胞线粒体膜电位荧光变化情况 采用激光共
目的蛋白相对于内参（GAPDH）的表达量。
聚焦显微镜进行观察。细胞培养及分组给药同“2.3.1”
2.7 统计学方法
项。培养24 h后，细胞用磷酸盐缓冲液洗涤1次，每孔加
使用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析。计量资
入 JC-1 工作液 1 mL，于 37 ℃下孵育 20 min，弃去上清
料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一
液；细胞用 incubation buffer 洗涤 2 次，加入 L-15 培养基
步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
2 mL，使用激光共聚焦显微镜观察各组细胞的荧光颜色
3 结果
及强度并拍照。
3.1 HJB对TNBC细胞增殖的影响
2.4.2 细胞线粒体膜电位变化情况 采用流式细胞术
与空白对照组比较，HJB 各浓度组 MDA-MB-231、
进行检测。细胞培养及分组给药同“2.3.2”项。培养
MDA-MB-468 细胞各时间点的增殖抑制率均显著升高
24 h 后，细胞用胰酶消化，用磷酸盐缓冲液洗涤 2 次，
（P＜0.05），且有一定的时间、浓度依赖趋势（表1）。HJB
以 2 000 r/min离心5 min，弃去上清液；细胞用JC-1工作
液500 μL重悬，于37 ℃下孵育15 min；悬液于室温下以 作 用 于 上 述 2 种 细 胞 24 h 的 IC50 值 分 别 为（21.57±
2 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液；细胞用 incubation 1.04）、（18.99±0.53）μmol/L，故将后续 HJB 的干预浓度
buffer洗涤2次，再用incubation buffer 500 μL重悬，使用 设置为10、20、40 μmol/L。
流式细胞仪检测各组细胞粒体膜电位的变化情况。 表1 HJB 对 2 种 TNBC 细胞增殖抑制率的影响（x±s，
2.5 细胞活性氧检测 n＝3）
2.5.1 细胞活性氧表达情况 采用激光共聚焦显微镜 组别 MDA-MB-231细胞增殖抑制率/% MDA-MB-468细胞增殖抑制率/%
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h
进行观察。细胞培养及分组给药同“2.3.1”项。培养 空白对照组 0 0 0 0 0 0
a
a
24 h 后，细胞用 10 μmol/L 的 2′，7′-二氯荧光黄双乙酸 HJB 5 μmol/L组 20.65±1.19 32.15±1.96 40.95±1.46 17.84±1.81 21.92±1.11 27.35±2.08 a
a
a
a
a
HJB 10 μmol/L组 32.91±1.65 52.06±1.02 57.56±1.57 30.34±0.59 42.71±6.31 55.63±1.97 a
a
a
a
a
盐（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）
HJB 20 μmol/L组 53.04±1.44 61.12±2.02 74.68±1.82 54.52±1.82 73.78±4.01 79.83±1.20 a
a
a
a
a
a
工作液（以无血清的 L-15 培养基稀释，下同）重悬，于 HJB 40 μmol/L组 64.34±1.03 71.02±1.23 81.75±1.64 72.98±0.15 81.96±2.15 86.97±0.45 a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
37 ℃下孵育20 min；细胞用无血清的L-15培养基洗涤3 HJB 80 μmol/L组 72.25±0.78 83.47±0.98 90.02±0.56 79.92±1.31 86.03±3.72 92.11±1.45 a
次，使用激光共聚焦显微镜观察各组细胞的荧光强度并 a：与空白对照组比较，P＜0.05
拍照。 3.2 HJB对TNBC细胞凋亡的影响
2.5.2 细胞活性氧水平变化情况 采用流式细胞术进 AO/EB双染色法观察结果显示，空白对照组2种细
行检测。细胞培养及分组给药同“2.3.2”项。培养 24 h 胞的细胞核染色均一，呈绿色，且结构正常；随着给药浓
后，细胞用胰酶消化，以 10 μmol/L 的 DCFH-DA 工作液 度的增加，被染成橙红色的凋亡细胞逐渐增多。结果见
重悬，于 37 ℃下孵育 20 min（每隔 5 min 颠倒混匀 1 次， 图 1（以 MDA-MB-231 细胞为例）。流式细胞术结果显
使细胞与探针充分接触）；细胞用无血清的 L-15 培养基 示，与空白对照组比较，HJB各浓度组2种细胞的总凋亡
洗涤3次，采用流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度，用 率均显著升高（P＜0.05）。结果见图2（以MDA-MB-231
以评估其活性氧水平的变化情况。 细胞为例）、表2。
中国药房 2023年第34卷第12期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 12 · 1417 ·