Page 60 - 《中国药房》2023年11期
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左 前 降 支(left anterior descending branch,LAD)建 立 2.8 大鼠心肌组织中PIK3/Akt信号通路相关蛋白磷酸
AMI模型。记录开胸前后大鼠标准肢体Ⅱ导联心电图。 化水平检测
以结扎后心肌变白、跳动减弱,同时出现心电图S-T段迅 采用 Western blot 法进行测定。取大鼠梗死心肌组
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速抬高视为冠状动脉结扎成功 。随后挤出胸腔空气, 织50 mg(假手术组大鼠取相应部位的心肌组织50 mg),
并迅速缝合胸腔,待大鼠能自主呼吸时拔掉呼吸机,完 加入蛋白质裂解液,匀浆后收集上清液,采用BCA法检
成模型制作。假手术组仅穿线不结扎。 测总蛋白含量,高温变性处理。取变性总蛋白 50 μg 进
2.3 分组与给药 行十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(分离胶电压 80
取 97 只大鼠,按照“2.2”项下方法制备 AMI 模型。 V,电泳时间 60 min;浓缩胶电压 80 V,电泳时间 45
取造模成功并存活的50只大鼠,按照随机数字表法分为 min),将蛋白转移至PVDF膜上(电流300 mA,转膜时间
5 组,即模型组(0.8% 羧甲基纤维素溶液)、阳性对照组 45 min),以 5% 脱脂奶粉封闭处理 1 h;加入 PI3K(稀释
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(复方丹参片,300 mg/kg )和艾纳香总黄酮低、中、高剂 比例为 1∶1 000)、p-PI3K Tyr607 (稀释比例为 1∶500)、Akt
量组(3、10、30 mg/kg,参考前期预实验结果设置),每组 (稀释比例为1∶1 000)、p-Akt Thr308 (稀释比例为1∶1 000)、
10 只;另取 10 只作为假手术组(0.8% 羧甲基纤维素溶 p-Akt ser473 (稀释比例为 1∶1 000)、GAPDH (稀释比例为
液)。各组大鼠灌胃给药,给药体积均为 3 mL/kg,药物 1∶500)一抗,4 ℃孵育过夜;TBST漂洗10 min×3次,加
的溶剂均为 0.8% 羧甲基纤维素溶液。手术 1 d 后开始 入二抗(稀释比例为 1∶5 000),37 ℃孵育 1 h。使用
给药,每天1次,连续4周。 ChemiDoc XRS+化学发光成像系统拍照,用 Image J
2.4 大鼠心电图S-T段变化观察 1.8.0 软件进行灰度统计分析,以 GAPDH 作为内参,以
大鼠手术前后心电图的变化主要表现为 S-T 段抬 磷酸化蛋白与未磷酸化蛋白条带灰度值的比值表示目
高。在术前、术后及给药后每周测量大鼠心电图 S-T 段 标蛋白的磷酸化水平。
的变化。按照“2.2”项下方法将大鼠麻醉后,仰卧位固 2.9 统计学方法
定,测量其标准肢体Ⅱ导联心电图,观察S-T段的变化。 采用Graph Pad Prism 8.0软件进行数据分析。多组
2.5 大鼠血流动力学指标检测 间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 LSD-t
末次给药1 h后,将大鼠按照“2.2”项下方法麻醉,分 检验。检验水准α=0.05。
离其右侧颈动脉,插入动脉导管,采用压力传感器将信 3 结果
号输入 MPA2000 生物信号分析系统,采集大鼠动脉收 3.1 大鼠心电图S-T段变化检测结果
缩 压(systolic blood pressure,SBP)、舒 张 压(diastolic 术前,各组大鼠心电图 S-T 段差异均无统计学意义
blood pressure,DBP)和平均动脉压(mean arterial pres‐ (P>0.05)。与假手术组比较,各组大鼠术后心电图S-T
sure,MAP);然后缓慢推进导管,待突然出现心室内压 段均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,给药后各组
波形时提示导管已经进入左心室,此时固定导管;待波 大鼠心电图S-T段均显著降低(P<0.05),给药后3周大
形稳定 5 min 后测大鼠左心室收缩压(left ventricular 鼠心电图 S-T 段的变化趋于平稳,且艾纳香总黄酮的作
systolic pressure,LVSP)、左心室舒张末压(left ventricu‐ 用具有一定的剂量依赖性趋势。结果见表1。
lar end diastolic pressure,LVEDP)、左心室内压最大上升
表1 各组大鼠心电图S-T段变化检测结果(x±s,n=10,mm)
速率(maximal left ventricular pressure rising rate,+LVdp/
组别 术前 术后 给药后1周 给药后2周 给药后3周 给药后4周
dtmax )和左心室内压最大下降速率(maximal left ventricu‐ 假手术组 1.12±0.12 1.87±0.14 1.11±0.13 1.01±0.13 1.06±0.12 1.04±0.11
a
lar pressure decreasing rate,-LVdp/dtmax )。 模型组 1.08±0.13 4.21±0.15 3.87±0.17 a 3.65±0.14 a 3.45±0.15 a 3.39±0.18 a
阳性对照组 1.11±0.07 4.12±0.25 3.11±0.19 ab 2.84±0.34 ab 2.43±0.25 ab 2.35±0.19 ab
a
2.6 大鼠血清心肌酶及炎症因子含量测定
艾纳香总黄酮低剂量组 1.13±0.08 4.17±0.25 3.56±0.15 ab 3.31±0.12 ab 3.02±0.18 ab 2.91±0.11 ab
a
大鼠血流动力学测试完毕后,于颈总动脉插管处取 艾纳香总黄酮中剂量组 1.15±0.07 4.15±0.25 3.21±0.13 ab 2.94±0.12 ab 2.67±0.09 ab 2.60±0.12 ab
a
血,静置30 min后,以3 000 r/min离心5 min,分离血清。按 艾纳香总黄酮高剂量组 1.20±0.07 4.19±0.25 3.11±0.14 ab 2.74±0.23 ab 2.33±0.13 ab 2.26±0.21 ab
a
相关试剂盒说明书方法操作,检测大鼠血清心肌酶(LDH、 a:与假手术组比较,P<0.05;b:与模型组比较,P<0.05
CK-MB)及炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)的含量。 3.2 大鼠血流动力学指标检测结果
2.7 大鼠心肌梗死情况检测 与假手术组比较,模型组大鼠 SBP、DBP、MAP、
取血完毕后,将大鼠处死,取出其心脏,称全心质 LVSP、+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax均显著降低(P<0.05),
量,将心尖到心底横向切成 0.1 cm 厚的心肌片,用生理 LVEDP 显著升高(P<0.05)。与模型组比较,阳性对照
盐水洗净,在37 ℃下以1%TTC溶液染色,30 min后立即 组和艾纳香总黄酮中、高剂量组大鼠 SBP、DBP、MAP、
用生理盐水冲去多余染料。梗死心肌不着色,非梗死心 LVSP、+LVdp/dtmax、-LVdp/dtmax均显著升高(P<0.05),
肌被染成红色。采用数码照相机进行拍照后剪去着色 LVEDP 均显著降低(P<0.05),且艾纳香总黄酮的作用
部分,称定未着色的梗死区质量。计算心肌梗死率:心 具有一定的剂量依赖性趋势。结果见表 2(1 mmHg=
肌梗死率(%)=梗死心肌质量/全心质量×100%。 0.133 kPa)。
· 1334 · China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 11 中国药房 2023年第34卷第11期