Page 54 - 《中国药房》2023年11期
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制EAE模型小鼠体内β-arrestin1的表达。造模第8天开                     的稀释比例为 1∶5 000，山羊抗兔来源二抗的稀释比例
          始，中药组、AAV-β+中药组小鼠给予20 g/kg益肾达络饮                     为 1∶10 000），室温孵育 90 min；TBST 洗膜 3 次，用 ECL
                                [9]
          药液（为临床等效剂量） ，阳性对照组小鼠给予 3.9                          化学发光法显色成像。使用 Image J 1.51j8 软件分析条
          mg/kg醋酸泼尼松混悬液（为临床等效剂量），正常组、模                        带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参 GAPDH 蛋白
          型组、AAV-β 组小鼠给予等体积生理盐水；每天灌胃 1                        条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。
          次，连续 14 d。每天按“2.2”项下方法进行神经功能评                       2.7 统计学方法
                                [10]
          分，评分≥1分即造模成功 。                                          采用 GraphPad Prism 9.0.0 软件对数据进行统计分
          2.2 神经功能评分                                          析。数据以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分
              从造模第1天开始，每天按照Weaver’s 15分评分法                    析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          对各组小鼠进行神经功能评分，持续 21 d：尾部半瘫记                         3 结果
          为 1 分，全瘫记为 2 分；四肢肢体力弱/步态改变记为 1                      3.1 各组小鼠神经功能变化情况
          分，不完全瘫痪记为 2 分，完全瘫痪记为 3 分；尾部与四                           正常组小鼠未见神经功能异常的症状；其他组小鼠
                                                      [10]
          肢分数相加为小鼠的神经功能评分；死亡记为15分 。                           于造模后 10 d 左右陆续开始发病，逐渐出现尾部无力、
          2.3 样本取材                                            四肢力弱、步态异常、尾部及四肢瘫痪等症状。与模型
              造模 21 d 后取材。每组取 10 只小鼠的血清用于                     组比较，中药组、AAV-β+中药组、阳性对照组小鼠的最
          ELISA检测：麻醉小鼠后，摘眼球取血约1 mL至1.5 mL                     高神经功能评分和造模后 21 d 的神经功能评分均显著
          离心管中，室温静置 30 min，在 4 ℃下以 1 000×g 离心                 降低（P＜0.05 或 P＜0.01）；与 AAV-β 组比较，AAV-β+中
          15 min，取上层血清，于－20 ℃保存，备用。取血完成                       药组小鼠的最高神经功能评分显著降低（P＜0.05），
          后，每组取 3 只小鼠用于染色实验：将小鼠固定在鼠板                          AAV-β+中药组和阳性对照组造模后21 d的神经功能评
          上，剪开胸腔，用生理盐水灌注心脏至肝脏呈灰白色，改                           分均显著降低（P＜0.05）。结果见表1。
          用4%多聚甲醛灌注，待尾巴与四肢抽搐结束，取出完整
                                                                 表1 各组小鼠神经功能评分比较（x±s，n＝10）
          的脑和脊髓，用 4% 多聚甲醛固定 48 h。另外，每组取 3
                                                              组别          平均发病时间/d  最高神经功能评分/分  造模后21 d的神经功能评分/分
          只小鼠用于 Western blot 实验：断头后迅速取出脑和脊                    正常组            0          0            0
          髓组织，速冻于液氮中标记备用。                                     模型组          10.5±0.5 a  4.38±1.09 a  3.20±1.34 a
                                                              AAV-β组       10.1±0.9  3.99±2.50     2.82±1.08
          2.4 小鼠脑和脊髓组织的病理形态学观察
                                                              中药组          11.7±0.9  3.51±0.58 b   2.65±1.78 b
              分别将小鼠脑和脊髓组织常规脱水浸蜡，石蜡包埋                          AAV-β+中药组    11.4±1.1  2.35±1.85 cd  1.98±0.76 bd
          后切片（4 μm），分别进行苏木精-伊红染色（hematoxylin                  阳性对照组        11.3±1.2  3.71±4.00 b   1.93±0.79 bd
          and eosin staining，HE）和劳克坚牢蓝（luxol fast blue，          a：与正常组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型组
          LFB）髓鞘染色，观察脑、脊髓组织的病理形态学改变。                          比较，P＜0.01；d：与AAV-β组比较，P＜0.05
          2.5 小鼠血清中炎症因子水平检测                                   3.2 各组小鼠脑和脊髓组织的HE染色情况
              取“2.3”项下血清，按照 ELISA 试剂盒说明书方法                        HE 染色结果显示，模型组与 AAV-β 组小鼠脑和脊
          操作，使用酶标仪在450 nm波长下测量光密度（OD）值，                       髓组织中大部分神经元可见胞体皱缩深染及炎症细胞
          通过标准曲线计算出小鼠血清中IL-2、IL-23、IFN-γ水平。                   聚集现象；中药组、AAV-β+中药组、阳性对照组小鼠脑
          2.6 小鼠脑和脊髓组织中 β-arrestin1、cAMP、PKA、                 和脊髓组织中可见神经元轻微水肿和胞体轻微皱缩深
          CREB蛋白表达水平的检测                                       染现象。结果见图1、图2。
              采用 Western blot 法进行检测。分别将小鼠的脑和                  3.3 各组小鼠脑和脊髓组织的LFB髓鞘染色结果
          脊髓组织剪碎，称取80 mg组织放入玻璃匀浆器中，加入                             LFB 髓鞘染色结果显示，除正常组外，其余各组小
          1 mL RIPA 裂解液、10 μL 苯甲基磺酰氟（PMSF），置于                 鼠均存在不同程度的脱髓鞘改变，并可见不同程度的神
          冰上研磨 30 min；将组织匀浆移至 1.5 mL 离心管中，在                   经纤维稀疏。其中模型组小鼠可见大面积白质区域脱
          4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，取上清。用二喹啉甲                 髓鞘改变，且较其他组更严重；AAV-β组较中药组、AAV-
          酸（BCA）法检测上清液中总蛋白浓度，取 40 μg 变性后                      β+中药组、阳性对照组脱髓鞘程度更严重。结果见图
          的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电                            3、图4。
          泳时间为 150 min，电压为 80、120 V），电泳结束后转膜                  3.4 各组小鼠血清中IL-2、IL-23、IFN-γ水平测定结果
          至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（转膜时间为90 min，转膜                          与正常组比较，模型组小鼠血清中IL-2、IL-23、IFN-
          电流为200 mA），用5%脱脂奶粉封闭1 h；加入GAPDH                     γ水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，
         （内参，稀释比例为 1∶5 000）一抗和 β-arrestin1、cAMP、              中药组小鼠血清中 IL-2、IL-23、IFN-γ 水平均显著降低
          PKA、CREB 一抗（稀释比例均为 1∶1 000），4 ℃孵育过                 （P＜0.05 或 P＜0.01），AAV-β 组小鼠血清中 IFN-γ 水平
          夜；以 TBST 洗膜 3 次，加入二抗（山羊抗小鼠来源二抗                      显著升高、IL-23 水平显著降低（P＜0.01），AAV-β+中药


          · 1328 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 11                            中国药房  2023年第34卷第11期
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