Page 53 - 《中国药房》2023年11期
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and  cAMP  in  brain  and  spinal  cord  tissues  were  significantly  increased  in  AAV- β +TCM  group （P＜0.05  or  P＜0.01）.
          CONCLUSIONS  Yishen daluo decoction can inhibit the expression of β-arrestin1 in the central nervous system thus activating the
          cAMP/PKA/CREB signaling pathway， relieving nervous system inflammation， and ultimately alleviates the symptoms of EAE.
          KEYWORDS    Yishen daluo decoction； experimental autoimmune encephalomyelitis； β-arrestin1； protein kinase A； cAMP response
          element binding protein； inflammatory factor


              多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是一种以中枢             赛百盛基因技术有限公司合成；百日咳毒素（批号 180，
                                               [1]
          神经系统炎性脱髓鞘为特征的自身免疫病 。MS 迄今                          规格 50 µg）购自美国 List Biological Laboratories 公司；
          为止病因不明，临床表现复杂多样，疾病过程难以预测，                          弗氏完全佐剂（批号 F5881）购自美国 Sigma 公司；灭活
          缺乏生物标志物，目前仍无法治愈。中药复方益肾达络                           结核杆菌（批号R19021，规格50 mg）购自上海瑞楚生物
          饮是北京中医药大学东直门医院高颖教授研究团队根                            科技有限公司；AAV-β购自上海吉凯基因医学科技股份
          据多年临床经验，由中医经典名方地黄饮子化裁而来，                           有限公司；兔源β-arrestin1多克隆抗体（批号bs-20232R）、
          在临床中取得了良好的治疗效果，其可缓解 MS 临床症                         鼠源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate
                                      [2]
          状、缩短MS病程、降低MS复发率 。                                 dehydrogenase，GAPDH）单 克 隆 抗 体（ 批 号 bsm-
              实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoim‐              33033M）、鼠源 cAMP 多克隆抗体（批号 bs-12707R）、鼠
          mune encephalomyelitis，EAE）是最接近 MS 病理改变的           源PKA多克隆抗体（批号bs-0520R）、鼠源CREB多克隆
                      [3]
          实验动物模型 。研究发现，在 EAE 模型小鼠和 MS 患                      抗体（批号 bs-20704R）、鼠源辣根过氧化物酶标记的山
                      +
          者外周血 CD4 T 细胞中，β-制动蛋白 1（β-arrestin1）的表             羊抗小鼠免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批号 bs-40296G-
                    [4]
          达显著升高 。β-arrestin1 是一类具有多种生物学功能                    HRP）、鼠源辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗
          的细胞内支架蛋白，可作为细胞质到细胞核的信息分                           （批号 bs-40295G-HRP）均购自北京博奥森生物技术有
          子，通过传递 G 蛋白偶联受体信息来影响相关信号通                          限公司；小鼠白细胞介素 2（interleukin，IL-2）、IL-23 酶
          路，从而调控染色质表观遗传；并且，β-arrestin1 可产生                   联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，
          包括环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）       ELISA）试 剂 盒（ 批 号 分 别 为 20221107-20176A、
          反应元件结合蛋白（cAMP response element binding             20221020-20179A）均购自黄石研科生物科技有限公司；
          protein，CREB）在内的转录复合物，从而影响 CREB 信                  小鼠 γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）EILSA 试剂盒（批号
          号通路，促使神经营养因子的表达，最终达到神经保护                           JL10967）购自上海江莱生物科技有限公司。
          作用并提高神经可塑性 。阻断 β-arrestin1 可使 G 蛋白                 1.3 动物
                              [5]
          偶联受体激活局部腺苷环化酶产生 cAMP，并激活细胞                             本研究所用动物为 SPF 级 C57BL/6J 雌性小鼠，共
                                                  [6]
          膜上的蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）活性 。本研               60只，6～8周龄，体质量为16～18 g，由辽宁长生生物技
          究通过制备EAE模型小鼠，以β-arrestin1为切入点，注射                   术股份有限公司供应，动物生产许可证号为SCXK（辽）-
          β-arrestin1 siRNA 腺相关病毒（β-arrestin1 siRNA adeno-   2020-0001。动物饲养于长春中医药大学动物中心屏障
          associated virus，AAV-β）到小鼠体内抑制中枢神经系统               系统内，环境温度为20～22 ℃，相对湿度为（50±10）%，
          中β-arrestin1的表达，并观察益肾达络饮干预后，对EAE                   12 h 光照/12 h 黑暗循环。小鼠饲养期间给予普通饲料
          模型小鼠血清中相关炎症因子以及 cAMP/PKA/CREB                      和洁净水。本实验已通过长春中医药大学实验动物伦
          信号通路的影响，以期为中医药治疗MS提供实验依据。                          理委员会审查（批准编号为2020201）。
          1 材料                                               2 方法
          1.1 主要仪器                                           2.1 分组、造模与给药
              本研究所用的主要仪器有 Eclipse Ci-L 型显微镜、                     采用随机数字表法将 60 只小鼠分为 6 组，即正常
          DS-U3型成像系统（日本Nikon公司），JY600E型蛋白电                   组、模型组、中药组、阳性对照组、AAV-β组、AAV-β+中药
          泳系统（北京君意东方电泳设备有限公司），WGD-20型                        组，每组10只。适应性饲养7 d后，除正常组外，其他各
          化学发光成像仪（美国 Bio-Rad 公司），HBS-1096A 型酶                组小鼠均按以下方法制备EAE模型：于小鼠背部皮下分
          标分析仪（南京德铁实验设备有限公司）。                                4 点（50 μL/点）注射抗原乳剂共 200 μL[抗原乳剂含
          1.2 主要药品与试剂                                        MOG35-55 250 μg、灭活结核杆菌 800 μg、磷酸盐缓冲液
              益肾达络饮（汤剂）由本课题组按照文献[7]方法制                      （PBS）100 μL、弗氏完全佐剂 100 μL，使用前充分吹打
          备，规格为每毫升药液含生药总量 2 g。醋酸泼尼松片                         混匀]；分别在注射抗原乳剂 30 min 和 48 h 后腹腔注射
                                                                                                      [8]
         （批号H41020214，规格5 mg/片）购自新乡市常乐制药有                    百日咳毒素溶液100 μL（含百日咳毒素500 ng） 。造模
          限公司；MOG35-55多肽（多肽序列为 N-MEVGWYRSPF-                 第 4 天，AAV-β 组与 AAV-β+中药组小鼠尾静脉注射
                                                                                             11
          SRVVHLYNGK-C，批号 190402-1，纯度 98.4%）由北京              AAV-β（150 μL/只，病毒滴度为 1×10  vg/mL），用以抑

          中国药房  2023年第34卷第11期                                              China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 11    · 1327 ·
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