Page 74 - 《中国药房》2023年9期
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40、80 μmol/L，浓度根据前期预实验结果设置）、3m不同                    A431、Colo-16 细胞接种于 6 孔板中，培养 24 h 后，按
          浓度组（5、10、20、40、80 μmol/L，浓度根据前期预实验                 “2.3”项下方法分组与给药，每组设 3 个复孔，干预处理
          结果设置），另设置空白组（无细胞和药物，仅含培养                            48 h；用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化细胞，制成5×10                   5
          基），每组设3个复孔。继续培养24、48、72 h后每孔加入                      个/mL的单细胞悬液后，用预冷PBS洗涤2次；加入预冷
          CCK-8 试剂 10 μL，孵育 2 h 后采用酶标仪于 450 nm 波              75%乙醇，于4 ℃隔夜固定，以1 500 r/min离心5 min，弃
          长处检测各孔光密度值（optical density，OD），计算细胞                 上清液；用预冷 PBS 洗涤 1 次，加入 500 μL 染色工作液
          增殖活力，细胞增殖活力（%）＝[1－（对照组 OD－给药                        [含 25 μL 碘化吡啶（pyridine iodide，PI）、10 μL 核糖核
          组 OD）/（对照组 OD－空白组 OD）]×100%；然后计算                    酸酶 A]，避光温浴 30 min，采用流式细胞仪检测 2 种细
          48 h 时 5-FU 和 3m 对 2 种细胞的半数抑制浓度（IC50 ）。             胞的周期分布。另同上述方法分组、给药、干预、制成单
          实验重复3次。                                             细胞悬液后，加入 500 μL 染色缓冲液，再加入 5 μL
          2.3 A431、Colo-16细胞的形态观察                             Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，避光染色30 min，采用流式
              取对数生长期的 A431、Colo-16 细胞接种于 6 孔板                 细胞仪检测2种细胞的凋亡情况。实验均重复3次。
          中，培养至细胞密度为70%左右，弃培养基，然后分别分                          2.8 A431、Colo-16 细胞中 JAK2/STAT3 信号通路相关
          为 3m 低、高浓度组（15、30 μmol/L，浓度根据“2.2”项下                基因mRNA表达的检测
          结果设置）和对照组（含 0.1%DMSO 培养基），每组设 3                         采用RT-PCR法检测。取对数生长期的A431、Colo-16
          个复孔；加入相应药物或培养基培养 48 h 后，采用倒置                        细胞接种于 6 孔板中，培养至细胞密度为 70% 左右，按
          显微镜观察各组细胞的形态并拍照。实验重复3次。                            “2.3”项下方法分组与给药，每组设 3 个复孔；培养 48 h
          2.4 A431、Colo-16细胞克隆形成率的检测                          后收集细胞，提取总 RNA，检测浓度及纯度后，根据
              取对数生长期的 A431、Colo-16 细胞接种于 6 孔板                 RT-PCR 试剂盒说明方法操作，以 β-actin 为内参，采用
          中，培养至细胞密度为70%左右，按“2.3”项下方法分组                        2 －ΔΔCt 法计算目的基因 mRNA 的表达水平。实验重复 3
          与给药，每组设3个复孔；培养48 h后，用胰酶消化细胞，                        次。本研究 PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限
          然后以 1 400 个/孔接种于 6 孔板中继续培养；隔 4 d 换 1                公司设计合成，引物序列及产物长度见表1。
          次培养基，培养14 d后用甲醛固定，结晶紫染色，进行克                                   表1 PCR引物序列及产物长度
          隆计数，并计算细胞克隆形成率，细胞克隆形成率                              基因                  引物序列               产物长度/bp
         （%）＝克隆数/接种数×100%。实验重复3次。                             JAK2         上游：5′-GTCCACCAGCGGAATTTAT-3′  127
                                                                           下游：5′-ATCTCATCTGGGCATCCAT-3′
          2.5 A431、Colo-16细胞迁移率的检测
                                                              STAT3        上游：5′-GCGTCCATCCTGTGGTA-3′  139
              采用划痕实验进行检测。取对数生长期的 A431、                                     下游：5′-TCAGTCCTCGCTTGGTG-3′
          Colo-16细胞制成单细胞悬液后接种于6孔板中，当细胞                        Bcl-2        上游：5′-TTCATCGTCCCCTCTCC-3′  150
          单层融合后，吸弃培养基；采用灭菌枪头划痕，以磷酸盐                                        下游：5′-TCAGTCCGGTATTCGCA-3′
                                                              Bax          上游：5′-ATGGGCTGGACATTGGAC-3′  106
          缓冲液（PBS）轻轻冲洗划痕后残留的细胞及碎片，然后                                       下游：5′-GGGACATCAGTCGCTTCAG-3′
          按“2.3”项下方法分组与给药（各组均含5%胎牛血清），                        β-actin      上游：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′  144
          每组设3个复孔；于0、48 h时采用倒置显微镜观察和拍                                      下游：5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′
          照，计算细胞迁移率，细胞迁移率（%）＝（0 h划痕面积－                        2.9 A431、Colo-16 细胞中 JAK2/STAT3 信号通路相关
          48 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。实验重复3次。                      蛋白表达的检测
          2.6 A431、Colo-16细胞侵袭数的检测                                采用 Western blot 法检测。取对数生长期的 A431、
              采 用 Transwell 实 验 进 行 检 测 。 将 饥 饿 24  h 的       Colo-16细胞接种于6孔板中，培养至细胞密度为70%左
          A431、Colo-16 细胞用胰酶消化后，离心保留沉淀，然后                     右，按“2.3”项下方法分组与给药，每组设3个复孔；处理
          按“2.3”项下方法分组与给药（各组均不含血清），每组设                        48 h 后用 PBS 清洗，加入蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂
                                               5
          3 个平行。重悬各组细胞稀释制成 2.5×10 个/mL 的单                     等进行裂解，离心收集蛋白样品，经 BCA 法定量后，加
          细胞混悬液，取 200 μL 接种于已凝固的含 1% 基质胶                      入缓冲液煮沸变性蛋白。将蛋白样品进行十二烷基硫
         （以 DMEM 高糖培养基配制）的 Transwell 小室上室，下                   酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜，以 5% 脱脂奶粉封
          室加入 700 μL 含 20% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基，                  闭2 h；加入相应一抗（JAK2、STAT3、p-JAK2、Bax、Bcl-2
          培养48 h；取出小室，以甲醛固定后进行结晶紫染色，擦                         的稀释比例均为 1∶500，p-STAT3、β-actin 的稀释比例均
          拭上室内层细胞。每个小室随机选取5个视野在倒置显                            为 1∶1 000）2 h，TBST 洗膜 30 min；加入相应二抗（稀释
          微镜下拍照，并计算细胞侵袭数，细胞侵袭数＝5个视野                           比例为 1∶3 000）孵育 1 h，TBST 洗膜 30 min；采用 ECL
          细胞总数/5。实验重复3次。                                      发光液显影，采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以
          2.7 A431、Colo-16细胞周期分布及凋亡率的检测                       p-JAK2与JAK2、p-STAT3与STAT3的比值表示蛋白磷酸
              采 用 流 式 细 胞 术 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 的           化水平，以Bax、Bcl-2与β-actin的比值表示蛋白表达水平。


          · 1088 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 9                              中国药房  2023年第34卷第9期
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