Page 50 - 《中国药房》2023年9期
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死小鼠，然后收集各组小鼠肺组织和支气管组织。取造                            2.7 ASMCs 中 α-SMA、IL-1β、SOCS1、p38 MAPK、p-
          模组小鼠肺组织适量，以4%多聚甲醛溶液固定，然后进                           p38 MAPK蛋白表达水平的检测
          行包埋、切片、染色、封片等操作，采用显微镜观察造模                               采用 Western blot 法进行检测。将 ASMCs 按 2.0×
                                                                5
          组小鼠肺组织病理形态学情况，当其发生病理改变时，                            10 个/孔接种于6孔板中，取对数生长期的细胞，按“2.2”
          表明造模成功。                                             项下方法分组、给药与培养，每组设3个复孔。培养结束
          2.3 ASMCs的形态观察及鉴定                                   后，收集细胞，加入适量 RIPA 裂解液匀浆至充分裂解，
              在无菌条件下将“2.2”项下分离的正常组和造模组                        BCA法进行蛋白定量，然后煮沸变性。取20 μg蛋白进
                                                       [12]
          小鼠支气管组织以PBS洗2遍，然后利用组织贴片法 ，                          行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂
                                                              奶粉封闭 1 h，加入 α-SMA、IL-1β、SOCS1、p38 MAPK、
          于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养原代 ASMCs，以胰酶消
                                                              p-p38 MAPK、β-actin一抗（稀释度均为1∶1 000），4 ℃孵
          化传代，并采用光学显微镜对细胞进行形态学观察。在
                                                              育过夜；PBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗
          传代培养时，将正常组小鼠 ASMCs 接种至预先放置
                                                             （稀释度为 1∶2 000）孵育 1 h；加入 ECL 化学发光试剂，
          有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞长成单层后取出
                                                              室温条件下反应 1～2 min。采用凝胶成像分析系统进
          盖玻片，PBS 洗 2 次；以 4% 多聚甲醛固定细胞，加入
                                                              行分析，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（β-actin）条
          300 μL 0.3%Triton X-100，室温静置20 min；在盖玻片上
                                                              带灰度值的比值，表示目的蛋白的表达水平。
          滴加适量山羊血清工作液，37 ℃封闭 1 h；滴加 DAPI 染
                                                              2.8 统计学处理
          液孵育、封片。采用荧光显微镜观察ASMCs中α-SMA和
                                                                  采用 SPSS 23.0 软件进行统计分析。计量资料以
          结 蛋 白（Desmin）的 染 色 情 况 以 进 行 细 胞 鉴 定 ，当             x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
          ASMCs 内 α-SMA 呈红色，Desmin 呈绿色，表明 ASMCs               比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。
          培养成功。                                               3 结果
          2.4 ASMCs的转染                                        3.1 哮喘模型小鼠的肺组织病理形态学观察结果
              将对数生长期的造模组小鼠ASMCs离心后制备细                             与正常组小鼠比较，造模组小鼠肺组织可见肺泡壁
          胞悬液，接种于 6 孔板中（细胞转染时融合度为 80% 左                       增厚，粒细胞浸润，黏膜上皮细胞脱落；管腔内可见黏液
          右），根据 Lipofectamine 3000 试剂盒说明书操作，分别                及脱落的上皮细胞混合物，局部可见血管管壁增厚，厚
          转染SOCS1过表达载体和SOCS1-RNAi载体（即干扰载                      薄不一；偶见淋巴细胞灶性浸润，血管淤血扩张及小灶
          体），将转染后的细胞置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养                       性出血。这表明小鼠哮喘模型构建成功。结果见图1。
          4～6 h；更换培养基，继续培养至 48 h，收集细胞用于后
          续试验。
          2.5 分组、给药与培养
              本研究设置空白组（正常小鼠ASMCs）、模型组（哮
          喘 模 型 小 鼠 ASMCs）、Rhy-SLN 组（哮 喘 模 型 小 鼠
          ASMCs）、SOCS1 过表达组（转染 SOCS1 过表达载体的
                                                                      A.正常组                    B.造模组
          哮喘模型小鼠 ASMCs）、SOCS1-RNAi 组（转染 SOCS1-
                                                              图1 小鼠肺组织病理形态学观察显微图（HE染色，×200）
          RNAi载体的哮喘模型小鼠ASMCs）、SB203580组（哮喘
                                                              3.2 ASMCs的形态观察及鉴定结果
          模型小鼠ASMCs）。空白组、模型组、SOCS1过表达组、
                                                                  由图 2 可见，本研究培养的正常组和造模组小鼠原
          SOCS1-RNAi 组 ASMCs 以不含药的培养基培养 24 h，
                                                              代ASMCs形态大小不一，呈不规则形、梭形、三角形等。
          Rhy-SLN 组和 SB203580 组 ASMCs 分别以含 10 μmol/L
                                                              进一步对正常组小鼠 ASMCs 进行免疫荧光染色发现
          Rhy-SLN、SB203580的培养基培养24 h 。
                                           [13]
                                                             （见图3），细胞内α-SMA呈红色，Desmin呈绿色，细胞核
          2.6 ASMCs增殖活力的检测
                                                              呈蓝色，且90%以上细胞呈阳性染色，表明ASMCs培养
                                                     5
              采用MTT法进行检测。将ASMCs按1.0×10 个/孔
                                                              成功。
          接种于 96 孔板中，培养 24 h 后，按“2.5”项下方法分组、                  3.3 Rhy-SLN对ASMCs增殖的影响
          给药与培养，每组设3个复孔。培养结束后，加入20 μL                             与空白组比较，模型组 ASMCs 吸光度值显著升高
          新鲜配制的 MTT 溶液（5 mg/mL），培养 4 h；吸除上清                  （P＜0.05）。与模型组比较，Rhy-SLN组、SOCS1过表达
          液，每孔加入二甲基亚砜100 μL终止反应。采用酶标仪                         组和 SB203580 组 ASMCs 吸光度值均显著降低（P＜
          于570 nm波长处检测每孔吸光度值，以吸光度值评价细                         0.05），SOCS1-RNAi 组 ASMCs 吸光度值显著升高（P＜
          胞增殖情况，吸光度值越大，表明细胞增殖活力越强。                            0.05）。结果见表1。


          · 1068 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 9                              中国药房  2023年第34卷第9期
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