Page 54 - 《中国药房》2023年7期
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2.1.4 大鼠踝关节滑膜组织病理形态学观察 取血完                          h；充分洗涤后加入 ECL 发光液显影，并采用 Image J 软
          成后，处死大鼠，剖取右踝关节，置于 4% 多聚甲醛溶液                         件对蛋白进行分析，以目的蛋白与内参β-actin的灰度值
          中固定，以 20% 乙二胺四乙酸二钠溶液脱钙、乙醇梯度                         比值表示蛋白的表达水平。
          脱水、石蜡包埋、切片，取部分切片（剩余部分进行免疫                           2.2.4 细胞中 NF-κB 蛋白的定位检测 采用免疫荧光
          组化染色）进行HE染色，采用显微镜观察大鼠踝关节组                           法进行检测。将处于对数生长期的 RAW264.7 细胞以
          织的炎症细胞浸润、水肿、滑膜增生、血管充血等情况。                           1×10 个/孔接种于铺有盖玻片的6孔板中，培养12 h后
                                                                   6
          2.1.5 大鼠踝关节滑膜组织中 NF-κB 蛋白表达水平的                      分为空白对照组、LPS组和痛风立安胶囊组（250 μg/mL）。
          检测 采用免疫组化法进行检测。取“2.1.4”项下剩余                         除空白对照组外，LPS 组加入 0.1 μg/mL LPS，痛风立安
          切片（阳性对照组除外），以 NF-κB 作为一抗，其他操作                       胶囊组加入相应药物和0.1 μg/mL LPS；培养24 h后，取
          按照试剂盒说明书方法进行，以氧化二氨基联苯胺                              出盖玻片，加入 4% 多聚甲醛溶液固定细胞 15 min；以
         （DAB）显色，显微镜下控制染色程度。每张切片随机选                           0.1%TritonX-100对细胞打孔15 min，加入10%山羊血清
          取 5 个不同的视野，通过 Image-Pro Plus 6.0 图像分析软              封闭 30 h，加入 NF-κB 抗体于 4 ℃放置过夜，再加入
          件测量阳性染色区域的平均光密度（optical density，OD）                 Alexa Fluor  594标记山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（稀释
                                                                       ®
          值，OD值越大，表示蛋白表达水平越高。                                 度 1∶2 500），孵育 1 h；加入含 DAPI 的抗荧光淬灭封固
          2.2 体外实验                                            液封固，采用激光共聚焦显微镜进行观察，NF-κB 蛋白
          2.2.1 细胞活力检测 采用 CCK-8 法进行检测。将                       表达绿色荧光，细胞核表达蓝色荧光。
          RAW264.7细胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养                    2.3 统计学方法
          基中，置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养。将培养至对数                            采用 Graphpad Prism 8.0 和 IBM SPSS Statistics 26
                          3
          期的细胞以3×10 个/孔接种于96孔板中，培养12 h，然                      软件进行制图和统计学分析。数据以x±s表示，多组间
          后分为空白对照组和痛风立安胶囊不同质量浓度组                              比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检
         （62.5、125、250、500、1 000 μg/mL，以提取物计，其质量              验。检验水准α＝0.05。
          浓度根据预实验结果设置），以及阴性对照组（不接种细                           3 结果
          胞），每组设6个复孔。各孔加入相应含或不含药培养基                           3.1 体内实验结果
          培养 24 h 后，吸弃培养基，加入含有 10%CCK-8 试剂的                   3.1.1 痛风立安胶囊对大鼠踝关节肿胀程度的影响 与
          培养基，于37 ℃下孵育1～2 h；采用酶标仪在450 nm波                     正常组比较，模型组大鼠踝关节肿胀率显著升高（P＜
          长处测定各孔OD值，并计算细胞存活率[细胞存活率＝                           0.05）；与模型组比较，痛风立安胶囊中、高剂量组和阳性
         （OD 给药组－OD 阴性对照组 ）/（OD 空白对照组－OD 阴性对照组 ）×100%]。       对照组大鼠踝关节肿胀率均显著降低（P＜0.05）。结果
          2.2.2 细胞中 NO、IL-1β、ROS 水平的检测 将处于对                   见表1。
                                          3
          数生长期的 RAW264.7 细胞以 5×10 个/孔接种于 96 孔                 表1 各组大鼠踝关节肿胀率的测定结果（x±s，n＝10）
          板中，培养 12 h，然后分为空白对照组、LPS 组和痛风立
                                                              组别             致炎前踝关节周长/cm  致炎后踝关节周长/cm  踝关节肿胀率/%
          安胶囊62.5、125、250 μg/mL组（质量浓度根据“2.2.1”项               正常组              2.90±0.15   2.91±0.14  0.41±1.07
          下实验结果设置），每组设6个复孔。空白对照组加入培                           模型组              3.03±0.08   3.53±0.28  16.53±3.44 a
                                                              痛风立安胶囊低剂量组       3.03±0.22   3.47±0.26  15.05±4.26
                                      [12]
          养基，LPS 组加入 0.1 μg/mL LPS ，痛风立安胶囊各组
                                                              痛风立安胶囊中剂量组       2.97±0.11   3.27±0.23  10.05±2.16 b
          加入相应药物和0.1 μg/mL LPS；培养24 h后，收集上清                   痛风立安胶囊高剂量组       3.02±0.13   3.47±0.14  14.98±1.50 b
          液，根据NO、IL-1β检测试剂盒说明书方法操作，采用酶                        阳性对照组            2.99±0.04   3.30±0.22  10.59±3.11 b
          标仪于 540 nm 波长处检测 NO、IL-1β 水平。另将处于                      a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
          对数生长期的RAW264.7细胞以1×10 个/孔接种于6孔                      3.1.2 痛风立安胶囊对大鼠血清中IL-1β水平的影响 与
                                           6
          板中，同法培养细胞后，根据 ROS 检测试剂盒说明书方                         正常组比较，模型组大鼠血清中 IL-1β 水平显著升高
          法操作，采用流式细胞分析仪检测各孔细胞荧光强度，                           （P＜0.05）；与模型组比较，痛风立安胶囊高剂量组和阳
          荧光强度越强，表示ROS水平越高。                                   性对照组大鼠血清中IL-1β水平均显著降低（P＜0.05）。
          2.2.3 细胞中NF-κB蛋白表达水平检测 采用Western                    结果见表2。
          blot法进行检测。将处于对数生长期的RAW264.7细胞                       3.1.3 痛风立安胶囊对大鼠踝关节滑膜组织病理形态
                 6
          以 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，按“2.2.2”项下方法分                   学的影响 正常组大鼠踝关节滑膜细胞排列整齐，滑膜
          组、培养后，收集细胞，加入细胞裂解液提取蛋白，并检                           组织无炎症细胞浸润，关节腔内未见渗出液。模型组大
          测蛋白浓度。蛋白变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙                            鼠踝关节滑膜组织可见明显的病理改变，表现为滑膜增
          烯酰胺凝胶电泳，转膜，加入5%脱脂牛奶室温封闭1 h；                         生、水肿、血管充血、毛细血管增生、炎症细胞增多等。
          加入 NF-κB（稀释度 1∶2 000）、β-actin（稀释度 1∶5 000）          经痛风立安胶囊干预后，大鼠踝关节滑膜增生改善、炎
          抗体于4 ℃孵育过夜，充分洗涤后加入二抗，室温孵育1                          症细胞浸润减少。结果见图1。


          · 816 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 7                               中国药房  2023年第34卷第7期
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