Page 46 - 《中国药房》2023年7期
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repair at the fracture site by activating PI3K/Akt signaling pathway and promoting the protein expressions of PI3K and Akt1.
          KEYWORDS     luteolin； bone defect； osteogenic repair； angiogenesis； network pharmacology； molecular docking


              骨缺损又被称为节段性骨丢失，其病因复杂多样，                          蛋白裂解液（批号P0013B）、BCA蛋白定量试剂盒（批号
          包括高能创伤、骨肿瘤、感染等，会导致患者肢体功能缺                           P0010S）、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-
                                    [1]
          失，严重影响患者的生活质量 。目前临床上对大段骨                            PAGE）试剂盒（批号P0012A）、Western blot封闭液、胰蛋
          缺损尚无确切定义，一般将缺损范围达到骨周径50%以                           白酶、茜素红S染色液均购自上海碧云天生物技术有限
                                                 [2]
          上或长度2 cm以上的骨丢失称为大段骨缺损 。骨缺损                          公司；基质胶（批号356234）购自美国Corning公司；鼠源
          难以自行愈合，其修复有赖于血管生成与骨生成的协                             Akt1 抗 体（批 号 AF6261）、鼠 源 PI3K 抗 体（批 号
                                                        [4]
            [3]
          调 ，然而目前临床上的治疗方案成本高且应用局限 。                           AF6241）、辣根过氧化物酶标记的鼠源免疫球蛋白 G
          因此，开发具有体内血管和骨生成能力的药物/材料在骨                          （immunoglobulin G，IgG）二抗（批号 S0001）均购自美国
          缺损治疗方面有极大潜力。                                        Affinity 公 司 ；聚 偏 二 氟 乙 烯 膜（PVDF 膜 ，批 号
              补益肝肾中药可有效促进骨折愈合。据研究报道，                          IPFL00010）购自德国默克公司；ECL 超敏化学发光液
          补肾中药一方面可通过生长因子诱导，促进骨折端血管                           （批号P10100）购自苏州新赛美生物科技有限公司；其余
          形成，改善血液循环        [5―7] ；另一方面可促进骨髓间充质干               试剂为实验室常用规格，水为超纯水。
          细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）增殖与成骨           1.3 细胞
          分化  [8―10] 。本课题组早期研究发现，骨碎补总黄酮（total                     大鼠BMSC、RUVEC（批号分别为CP-R131、CP-R232）
          flavonoids of Rhizoma Drynariae，TFRD）具有促进牵张         均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
                                       [11]
          成骨间隙中的骨形成和重塑功能 ，可能通过磷脂酰肌                            2 方法
          醇 3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶     2.1 网络药理学分析
          B（protein kinase B，Akt）信号通路促进骨缺损血管生成                2.1.1 木犀草素的靶点预测 通过 PubChem 数据库
                [12]
          和成骨 。TFRD 有效成分较复杂，在其所有单体成分                         （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取木犀草素的分
          中，山柰酚、柚皮苷和木犀草素的活性最好，均具有促进                           子 结 构 ，通 过 SwissTargetPrediction 在 线 平 台（http：//
          成骨分化的作用       [13―15] 。从目前的研究进展来看，柚皮苷               www.swisstargetprediction.ch/）预测木犀草素的潜在靶
          及山柰酚促进成骨的相关研究较多，而木犀草素相对较                            点；利用 UniProtKB 数据库（https：//www.uniprot.org/）使
                                             [16]
          少，因此，本研究以既往实验结果为基础 ，通过网络药                           靶点名称标准化，并删除重复数据。
          理学和分子对接寻找木犀草素适配靶点蛋白及信号通                             2.1.2  骨 缺 损 相 关 靶 点 的 收 集  以“traumatic  bone
          路，以大鼠 BMSC 及大鼠脐周静脉内皮细胞（rat umbili‐                  defect”为关键词在 GeneCards 数据库（https：//www.gen‐
          cal vein endothelial cells，RUVEC）为研究对象，在细胞层         ecards.org/）、PharmGKB 数据库（https：//www.pharmgkb.
          面验证木犀草素与TFRD相似的促进成骨、成血管的功                           org/）、NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜
          能机制，以期为骨缺损治疗挖掘潜在的药物。                                索与骨缺损发病相关的靶点。合并去重后，将骨缺损相
          1 材料                                                关靶点与木犀草素预测靶点导入Venny 2.1 软件得到交
          1.1 主要仪器                                            集靶点并绘制Venny图，得到的交集靶点为木犀草素治
              TGL-16c 型冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器                       疗骨缺损的潜在作用靶点。
          开发有限公司；SCO6WE型恒温培养箱购自美国SHEL-                        2.1.3 核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用分析及Hub 基
          LAB 公司；DMi8-M 型倒置显微镜购自德国 Leica 公司；                  因的筛选 通过 String 数据库（https：//cn.string-db.org/）
          DR-200Bs型酶标检测仪购自无锡华卫德朗仪器有限公                         对核心靶点蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein
          司；PowerPac Basic 型电泳仪购自美国 Bio-Rad 公司；               interaction，PPI）进行分析，得到 PPI 网络图；利用 Cyto‐
          Micro Publisher 型成像系统购自加拿大 QImaging 公司；             scape 3.8 软件对 PPI 网络进行拓扑学分析，以度值（de‐
          WD-9405F 型脱色摇床购自北京六一仪器有限公司；                         gree）、介数中心性（betweenness centrality，BC）、接近中
          FB201型扫描仪购自日本Canon公司。                               心性（closeness centrality，CC）等参数筛选2次，获得PPI
          1.2 主要药品与试剂                                         网络中的核心蛋白。
              木犀草素溶液（批号DA21442，纯度≥98％）购自南                     2.1.4 京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析
          京道斯夫生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（PBS）、                           和基因本体功能富集分析 利用 Kobas 数据库（http：//
          DMEM 低糖培养基、胎牛血清均购自美国 Gibco 公司；                      kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/）对木犀草素治疗骨缺损的
          BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒（批号 C3206）、成骨                    潜在作用靶点进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto
          细胞钙化结节染色试剂盒（批号 C0148S）、RIPA 细胞总                     encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富


          · 808 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 7                               中国药房  2023年第34卷第7期
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