Page 48 - 《中国药房》2023年7期
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并通过电印迹转移至PVDF膜上。将PVDF膜在室温下                          factor receptor，EGFR）、环加氧酶 2（cyclooxygenase 2，
          于封闭液中封闭 45 min，然后在 4 ℃与 Akt1 抗体、PI3K                PTGS2）、基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，
          抗体（稀释度均为1∶1 000）一起孵育过夜。洗涤3次后，                       MMP-9）。
          将目标蛋白条带与二抗（稀释度为 1∶5 000）在室温下                        3.1.3 KEGG 信号通路富集分析结果 通过 KEGG 富
          孵育 1 h。加入显影液后进行目的蛋白显影，实验共重                          集得到197条信号通路，选取重要性排名前20位的信号
          复 3 次。使用 Image J 软件对条带进行灰度值分析，以                     通路绘制气泡图（图 2）。结果显示，潜在靶点主要富集
          PI3K、Akt1与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示                   在肿瘤中的通路（pathways in cancer）、氮代谢（nitrogen
          目的蛋白表达水平。                                           metabolism）和 PI3K/Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling
          2.4 统计学处理                                           pathway）等相关通路中。
              采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料满足                      3.1.4 GO 功能富集分析结果 GO 功能富集分析共得
          正态分布以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，进一                         到 1 670 条 GO 条目，选取重要性排名前 10 位的条目进
          步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。                          行可视化分析（图 3）。结果显示，其生物过程涉及蛋白
          3 结果                                                质磷酸化（protein phosphorylation）、凋亡过程的负反馈
          3.1 网络药理学分析结果                                       调节（negative regulation of apoptotic process）、对外源刺
          3.1.1 木犀草素、骨缺损相关靶点及潜在作用靶点 通                         激的反应（response to xenobiotic stimulus）等；细胞组成
          过 PubChem 数据库共筛选得到木犀草素的潜在靶点                         涉及胞质溶胶（cytosol）、细胞质（cytoplasm）、细胞核
          103 个。通过 Genecards、PharmGKB、NCBI 数据库搜索             （nucleus）等；分子功能主要集中于蛋白激酶活性（pro‐
          并汇总、去重后，共得到骨缺损相关靶点 14 161 个。利                       tein kinase activity）、碳酸盐脱水酶活性（carbonate dehy‐
          用 Venny 2.1 软件，得到骨缺损与木犀草素交集的靶点                      dratase activity）、三磷酸腺苷结合（ATP binding）等。
          97个，即为木犀草素治疗骨缺损的潜在作用靶点。                             3.1.5 分子对接验证结果 本研究以木犀草素为研究
          3.1.2 PPI分析及Hub基因筛选结果 将上述97个交集                      载体，以重要性排名前2位的靶点（Akt1、SRC）进行分子
          靶点导入String数据库和Cytoscape 3.8软件，得到PPI网                对接。结果表明，木犀草素与Akt1、SRC的结合能分别为
          络图；隐藏游离节点，对 PPI 网络进行拓扑学分析，结果                        －34.2、－20.8 kJ/mol，均小于－5 kJ/mol，表明均具有较
          显示，该网络中包含 92 个节点和 996 条边，网络中节点                      强的结合力，相互作用关系见图 4。其中，木犀草素与
          越大、颜色越深，节点的 degree 值越大，代表其在 PPI 网                   Akt1的氨基酸残基LYS179、ALA230、ASN279形成氢键
          络中的作用越重要。利用网络拓扑学参数进行 Hub 基                          相互作用，与 SRC 的氨基酸残基 GLU339、GLU157、
          因筛选，第 1 次以 degree 值大于 2 倍中位数，BC 值、CC                LYS321、TYR326形成氢键相互作用。
          值大于中位数为条件筛选，第 2 次以 degree 值、BC 值、                   3.2 体外实验验证结果
          CC值大于中位数为条件筛选（图1），最终得到12个Hub                        3.2.1 木犀草素对 BMSC 成骨分化的影响 碱性磷酸
          基因，排名前6位依次为Akt1、SRC、雌激素受体1（estrogen                 酶染色结果显示，木犀草素 0 μmol/L 组蓝色几乎不可
          receptor 1，ESR1）、表皮生长因子受体（epidermal growth          见，木犀草素 1 μmol/L 组则相对明显，木犀草素 10













                                                               Akt1
                                                                                            Akt1







                                         degree＞15                       degree＞32
                                         BC＞0.003 527                    BC＞0.016 741
                                         CC＞0.433 333                    CC＞0.491 892
                    A. PPI网络图                            B.第1次筛选                          C.第2次筛选
                                                 图1 Hub基因筛选过程


          · 810 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 7                               中国药房  2023年第34卷第7期
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