Page 47 - 《中国药房》2023年7期
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集分析和基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析，                  察显色深度并拍照，实验共重复3次。以碱性磷酸酶染
          筛选出P＜0.05的信号通路和生物过程（biological proc‐               色后孔板中蓝色深度及分布范围为评价标准，颜色越
          see）、细胞组分（cellular component）、分子功能（molecu‐         深，分布范围越广，说明细胞碱性磷酸酶活性越高。
          lar function）条目。对重要性排名前20位的KEGG信号                  2.3.3 细胞钙化情况检测 采用茜素红S染色。选取3
          通路和排名前 10 位的 GO 功能条目绘制气泡图和柱状                       代 BMSC 消化接种于 24 孔板中，1 d 后分别给予含不同
          图，并构建“成分-靶点-信号通路”可视化网络。                            浓度木犀草素溶液（0、1、10 μmol/L）的成骨诱导液进行
          2.2 分子对接                                           干预，给药剂量参考文献[15]和本课题组前期预实验结
              通过分子对接技术分析核心靶点与木犀草素的作                          果设置。每3 d更换1次培养基，14 d后使用成骨细胞钙
          用关系。从PubChem数据库得到木犀草素的分子结构，                        化结节染色试剂盒进行染色。首先吸出残余培养基，以
          将其导入Chem 3D软件进行能量最小化，得到小分子的                        PBS清洗2次，再使用含4%多聚甲醛的细胞固定液固定
          pdb 文件；在 PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）中搜索         细胞，室温条件下固定 30 min 后去除残留液体，用 PBS
          核心靶点蛋白的结构，利用 PyMOL 软件删除水分子和                        冲洗3次，每次5 min。然后加入茜素红S染色液，37 ℃
          小分子配体；最后利用 AutoDock Tool 1.5.7 软件将处理               恒温孵育 30 min，每 5 min 查看 1 次，显色达到预期深浅
          得到的木犀草素小分子和核心靶点进行分子对接，以验                           即终止。去除染色液，用PBS清洗2次，终止反应。最后
          证结果的可靠性。以木犀草素与核心靶点的对接结合                            置于扫描仪下观察显色深度并拍照，实验共重复 3 次。
          能来评价结合亲和力，若结合能＜－5 kJ/mol，说明具有                      以茜素红 S 染色后孔板中红色深度及分布范围为评价
          结合亲和力，且结合能的数值越低，说明结合亲和力越                           标准，颜色越深，分布范围越广，说明钙盐沉积越多，钙
          强，结合越稳定。                                           化结节数量越多。
          2.3 体外实验验证                                         2.3.4 细胞血管分化能力检测 采用体外血管形成实
          2.3.1 细胞培养与传代 将冻存的RUVEC和BMSC在                      验检测。实验前 1 d 将基质胶、1 盒 100 μL 枪头置于冰
          37 ℃水浴中复温后，在超净台分别转入含 5 mL 完全培                      盒中，放入 4 ℃冰箱过夜，使基质胶能够在低温条件下
          养基的 15 mL 离心管中，在 24 ℃以 1 200 r/min 离心 5            融化。实验当天使用预冷的枪头将基质胶在冰上接种
          min去上清液。重新添加5 mL完全培养基，混匀后移入                        到血管生成载玻片上，每孔10 μL均匀覆盖板底，避免产
          培养皿中，在 37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育，第 2 天更                   生气泡，随后将血管生成载玻片的盖子盖上，置于10 cm
          换培养基。待细胞生长至融合度为 80%～90% 时进行                        的培养皿中，放入浸水的纸巾，制成1个湿盒，将其放入
          传代。吸除培养基，加入 2 mL PBS 清洗 3 次。去除                     37 ℃、5% CO2的培养箱中，孵育 30 min 以固化基质胶。
          PBS，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶进行消化，待细胞圆缩后，                   将 50 μL 经不同浓度木犀草素溶液（0、1、10 μmol/L）预
          加入4 mL完全培养基吹打混匀终止消化，用15 mL离心                       处理的 RUVEC（5 000 个细胞）加入血管生成载玻片中
          管暂存细胞悬液，然后在24 ℃以1 200 r/min离心5 min，                并在 37 ℃、5% CO2培养箱培养 6 h，给药剂量参考文献
          去除上清液，加6 mL完全培养基至细胞沉淀，吹打混匀                         [15]和本课题组前期预实验结果设置。随后在倒置显微
          后，分别转移至2个培养皿中，补全完全培养基至5 mL。                        镜下的5个随机视野中观察RUVEC的形态变化和血管
          移入 37 ℃、5% CO2的培养箱培养，24 h 后换液，显微镜                  形成情况，实验共重复 3 次。使用 Image J 软件中的
          观察，待细胞贴壁融合后换液；用不含血清的DMEM培                         “Analyze HUVEC Phase Contrast”函数计算平均血管
          养液培养24 h，用于后续实验。                                   长度。
          2.3.2 细胞碱性磷酸酶活性检测 采用碱性磷酸酶染                         2.3.5 细胞内 PI3K、Akt1 蛋白检测 采用 Western blot
          色。选取 3 代 BMSC 消化接种于 24 孔板中，1 d 后分别                 法检测，以验证网络药理学方法识别到的木犀草素成
          给予含不同浓度木犀草素溶液（0、1、10 μmol/L）的成骨                    骨、成血管潜在调节靶点及作用途径的可靠性。将
          诱导液进行干预，给药剂量参考文献[15]和本课题组前                         BMSC 接种到 6 孔板上，给予含不同浓度木犀草素溶液
          期预实验结果设置。每 3 d 更换 1 次培养基，7 d 后使用                  （0、1、10 μmol/L）的成骨诱导液干预 7 d，给药剂量参考
          BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒染色，首先吸出残余                       文献[15]和本课题组前期预实验结果设置。用PBS冲洗
          培养基，使用PBS清洗2次，再使用含4%多聚甲醛的细                         贴壁细胞3次，弃废液，然后加入适当体积的细胞总蛋白
          胞固定液固定细胞，室温条件下固定30 min后去除残留                        裂解液裂解；同时，用细胞刮刀刮下细胞和试剂，转到
          液体，用 PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。然后按照说明书配                  1.5 mL EP管中。冰上静置30 min，每隔5 min震荡混匀
          制染色工作液并加入24孔板中，37 ℃恒温孵育30 min，                     1 次。在 4 ℃以 12 000 r/min 离心 30 min，收集上清液，
          每5 min查看1次，显色达到预期深浅即终止。去除残留                        即为总蛋白溶液。使用BCA蛋白定量试剂盒测定其蛋
          液体，用PBS清洗2次，终止反应。最后置于扫描仪下观                         白浓度，随后将蛋白在6％浓度的电泳凝胶上电泳分离，


          中国药房  2023年第34卷第7期                                                 China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 7    · 809 ·
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