Page 30 - 《中国药房》2023年7期
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激活物抑制剂1（plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1） 不同抗凝剂的采血管中，其中枸橼酸钠抗凝血浆用于
试剂盒均购自南京建成生物工程研究所（批号均为 FIB 测定、酶联免疫吸附测定、血小板聚集率测定；
20181126）；纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）试剂盒购自北 EDTA-K2抗凝血浆用于血小板相关参数分析；肝素钠抗
京普利生仪器有限公司（批号为 1812077）；全蛋白提取 凝血浆用于全血黏度和血浆黏度测定；柠檬酸-葡萄糖
试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚 抗凝血浆用于蛋白表达测定。
丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒、ECL 发光液，兔源 2.3 血脂生化指标含量的测定
CD36、黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）、PI3K、 取“2.2”项下枸橼酸钠抗凝血浆，以3 000 r/min离心
Akt、磷酸化 Akt（p-Akt）单克隆抗体和辣根过氧化物酶 12 min，取上清液，严格按照 TC、TG、HDL-C、LDL-C 试
标记的羊抗兔 β-actin 单克隆抗体（二抗）均购自沈阳万 剂盒说明书方法操作，应用全自动生化分析仪检测上述
类生物科技有限公司（货号分别为 WLA019、WLA004、 指标的含量。
WLA013、WLA003、WL02390、WL03550、WL03380、 2.4 全血黏度、血浆黏度和血浆中FIB含量的测定
WL0003b、WLP001a、WL01845）；兔源磷脂酰肌醇 4-磷 取“2.2”项下肝素钠抗凝血浆适量，设置全自动血液
酸 5-激酶单克隆抗体（phosphatidylinositol 4-phosphate 流变仪高（200）、中（60）、低（10）3种不同的剪切参数，进
5-kinase，PIP5K）购自武汉三鹰生物技术有限公司（批 行全血黏度测定。另取肝素钠抗凝血浆适量，以 3 000
号 13361-1-AP）；兔源 p-Akt1/2/3 单克隆抗体购自美国 r/min 离心 12 min，取上层血浆，采用全自动血液流变仪
Affinity公司（批号AF3262）。 测定血浆黏度。取枸橼酸钠抗凝血浆适量，根据FIB试
1.3 实验动物及饲料 剂盒说明书方法操作，采用全自动血凝仪测定FIB。
本研究所用动物为Wistar大鼠，共70只，雄性，健康 2.5 血小板相关参数的测定
清洁级，体质量为220～240 g，由哈尔滨医科大学提供， 取“2.2”项下 EDTA-K2 抗凝血浆，采用全自动血细
实验动物生产合格证号为SCXK（黑）2016-001。大鼠饲 胞分析仪测定其中血小板计数（platelet count，PLT）、分
养于黑龙江中医药大学动物实验中心，环境22～25 ℃， 布 宽 度（platelet distribution width，PDW）和 平 均 体 积
12 h光照与12 h黑暗循环交替；每5只大鼠一笼，自由摄 （mean platelet volume，MPV）。
食饮水。本实验获得黑龙江中医药大学实验动物伦理 2.6 血小板生理特性和功能相关因子水平的测定
委员会批准（批准号为2018121510），实验过程严格执行 取“2.2”项下枸橼酸钠抗凝血浆适量，依据 vWF、
伦理委员会相关要求。本研究所用高脂饲料配方组成 Fn、PLA2、TXB2、6-keto-PGF1α、TXA2、PGI2、cAMP、
为 63.6% 基础饲料、15% 猪油、20% 蔗糖、1.2% 胆固醇、 cGMP、β-TG 试剂盒说明书操作，采用酶标仪测定上述
0.2%胆酸钠，购自北京科澳协力饲料有限公司。 指标水平。
2 方法 2.7 血小板聚集率和纤溶系统相关因子水平的测定
2.1 造模、分组与给药 取“2.2”项下枸橼酸钠抗凝血浆适量，以 800 r/min
将70只大鼠适应性喂养7 d后，随机分为基础组（14 离心 10 min，得上层富血小板血浆，再以 3 000 r/min 离
只）和高脂组（56 只）。基础组大鼠喂养基础饲料，高脂 心10 min，得上层乏血小板血浆。采用全自动血小板聚
组大鼠喂养高脂饲料以复制高脂血症模型；于第8周检 集仪测定血小板最大聚集率、60 s聚集率、180 s聚集率。
测大鼠血脂水平，参考《药理实验方法学》中标准——当 另取枸橼酸钠抗凝血浆适量，依据PAI-1、t-PA试剂盒说
血脂4项中有一项水平异常，则造模成功。将基础组大 明书方法操作，采用酶标仪测定上述指标水平。
鼠作为空白组，造模成功的大鼠随机分为模型组、辛伐 2.8 血小板中 CD36/PI3K/Akt 信号通路相关蛋白表达
他汀组（阳性对照，0.004 g/kg，剂量为临床等效剂量）和 水平的测定
丹参饮高、低剂量组（3.6、0.9 g/kg，以生药量计，高剂量 取“2.2”项下柠檬酸-葡萄糖抗凝血浆适量，第 1 次
为临床等效剂量），每组10只。各给药组大鼠每天灌胃 以 800 r/min 离心 15 min，取 2/3 体积的上清液进行第 2
相应药物，其余组大鼠灌胃等体积生理盐水，连续4周。 次离心（以 2 800 r/min 离心 10 min），分离上清液，得下
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本研究进行过程中，空白组大鼠继续喂养基础饲料，其 层血小板，调整血小板浓度为 2×10 个/mL。向调整浓
余组大鼠继续喂养高脂饲料；各组大鼠均有一定死亡。 度后的血小板中加入 1 mL 含蛋白酶抑制剂的裂解液，
2.2 样品采集 冰浴静置 30 min，以 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液
给药 4 周后，大鼠禁食、不禁水，于末次给药 30 min 采用 BCA 法测定蛋白浓度后，进行 SDS-PAGE 凝胶电
后进行麻醉取材。髂主动脉分叉处采血，分别置于放有 泳；转膜，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入相应一
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