Page 55 - 《中国药房》2023年1期

mg/mL RNase、50 μg/mL 碘 化 丙 啶（propidium iodide， （TBS）洗 3 次、每次 5 min，加入 DyLight 800 标记的二
TM
PI）和 0.05%Triton-100 的 PBS，混匀，室温避光染色 30 抗（稀释比例均为 1∶30 000），避光室温孵育 1.5 h；TBS
min，上样流式细胞仪测定各组细胞的细胞周期占比。 洗 3 次、每次 5 min，用双色红外成像系统检测和分析。
实验重复3次。 以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度
2.4 XCQ-9对细胞凋亡的影响 值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。实验重
取对数生长期细胞，按“2.3”项下方法接种、分组、给 复3次。
药、培养并收集细胞。用50 μL 1×Binding buffer混匀， 2.6 统计学方法
并加入 Annexin V-FITC 和 PI 各 2.5 μL，避光染色 15 采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，使用 GraphPad
min，上样流式细胞仪检测和分析。实验重复3次。 Prism 9.0软件作图。计量资料以x±s表示，多组间比较
2.5 XCQ-9对细胞中凋亡和周期相关蛋白表达的影响 采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。

采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期细 检验水准α＝0.05。
5
胞，按12×10 个/皿接种于60 mm培养皿中，置于培养箱 3 结果
中常规培养。待细胞稳定后，将其分为空白对照组（0 3.1 XCQ-9对Jurkat细胞增殖的影响
μmol/L）和不同浓度（2.5、5、10 μmol/L，浓度设置依据同 与空白对照组比较，作用 24、48、72 h 后，XCQ-9 不
“2.3”项下）的XCQ-9组。干预24 h后收集细胞，用预冷 同浓度组细胞的存活率均显著降低（P＜0.01），并呈时
的 PBS 清洗 3 次，加入 80～150 μL 含有 1% 苯甲基磺酰 间和浓度依赖性趋势。结果见表1。
氟的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，以12 000 r/min离心 表1 XCQ-9干预不同时间后各组细胞的存活率测定结
15 min，去沉淀得到细胞蛋白溶液。用BCA蛋白浓度检 果（x±s，n＝＝5，%%）
测试剂盒检测蛋白浓度，并将 5×loading buffer 和细胞 组别 24 h 48 h 72 h
空白对照组 100 100 100
蛋白溶液按1∶4的体积比混匀，95 ℃变性5 min，－80 ℃
XCQ-9 2.5 μmol/L组 82.59±1.45 a 77.84±1.45 a 72.58±2.40 a
保存备用。在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中， XCQ-9 5 μmol/L组 74.08±0.73 a 59.14±2.07 a 50.62±1.59 a
每孔加入50 μg蛋白，待蛋白分离完全后（电泳条件为电 XCQ-9 10 μmol/L组 61.04±2.41 a 44.26±1.59 a 34.48±0.56 a
XCQ-9 20 μmol/L组 60.81±1.51 a 38.19±1.34 a 27.62±1.26 a
压 100 V、时间 2 h），转移（转膜条件为电流 220 mA、时 XCQ-9 40 μmol/L组 61.20±1.55 a 33.87±0.94 a 22.99±0.14 a
间 2 h）到 0.2 μm 的聚偏二氟乙烯膜上，以 3% 牛血清白 a：与空白对照组比较，P＜0.01
蛋白室温封闭 1 h；加入相应的一抗（GAPDH、Cyclin 3.2 XCQ-9对Jurkat细胞凋亡的影响
B1、CDK1 的稀释比例均为 1∶5 000，Caspase-9、Cleaved 与空白对照组比较，作用 24、48 h 后，XCQ-9 5、10
Caspase-9、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、PARP 的稀释 μmol/L 组细胞的凋亡率均显著升高（P＜0.05 或 P＜
比例均为 1∶1 000），4 ℃孵育过夜；Tris 缓冲盐溶液 0.01），且呈浓度和时间依赖性趋势。结果见图2、表2。
10 7. 10 7. 10 7. 10 7.
10 7 10 7 10 7 10 7
10 6 10 6 10 6 10 6
PerCP-H 10 4 PerCP-H 10 4 PerCP-H 10 4 PerCP-H 10 4
24 h 10 5 10 5 10 5 10 5

10 3 10 3 10 3 10 3
10 2 10 2 10 2 10 2
10 1.6 10 1.6 10 1.6 10 1.6
6
6
7
5
7
6
2.1
4
3
7
6
2.1
4
3
2.1
5
3
5
4
7
3
4
10 10 10 10 10 10 10 8.4 10 10 10 10 10 10 10 8.4 10 10 10 10 10 10 10 8.4 10 10 10 10 10 10 10 8.4
2.1
5
FITC-H FITC-H FITC-H FITC-H
10 7. 10 7. 10 7. 10 7.
10 7 10 7 10 7 10 7
10 6 10 6 10 6 10 6
48 h
PerCP-H 10 5 4 PerCP-H 10 5 4 PerCP-H 10 5 4 PerCP-H 10 5 4
10
10
10
10
10 3 10 3 10 3 10 3
10 2 10 2 10 2 10 2
10 1.6 10 1.6 10 1.6 10 1.6
3
5
2.1
7
4
5
6
4
3
2.1
4
4
6
5
6
7
5
2.1
3
10 10 10 10 10 10 10 8.4 10 10 10 10 10 10 10 8.4 10 10 10 10 10 10 10 8.4 10 10 10 10 10 10 10 8.4
2.1
7
6
3
7
FITC-H FITC-H FITC-H FITC-H
A. 空白对照组 B. XCQ-9 2.5 μmol/L组 C. XCQ-9 5 μmol/L组 D. XCQ-9 10 μmol/L组
图2 XCQ-9干预24、48 h后各组细胞凋亡检测的流式细胞图
中国药房 2023年第34卷第1期 China Pharmacy 2023 Vol. 34 No. 1 · 49 ·