Page 54 - 《中国药房》2023年1期
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急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leuke‐            1640培养基购自美国Gibco公司；Annexin Ⅴ-FITC凋亡
          mia，ALL）是以未成熟 T 或 B 淋巴细胞异常增生为特征                     检测试剂盒（批号0315976）购自美国BD公司；二甲基亚
          的恶性克隆性疾病，根据免疫表型一般分为T细胞型和                            砜、MTT 和二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒（批
                  [1]
          B 细胞型 。ALL 多发病于 2～5 岁，是儿童最常见和发                      号分别为 401P031、810K052、20211213）均购自北京索
          病率最高的恶性肿瘤，且其发病率呈逐年上升的趋                              莱宝科技有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceral‐
          势 [2―4] 。其中，急性 T 淋巴细胞白血病（T-cell acute lym‐          dehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（批号
          phoblastic leukemia，T-ALL）是一种侵袭性疾病，在儿童              62u0922）购自美国 Affinity 公司；兔源细胞周期蛋白依
                                [5]
          ALL病例中占10%～15% 。目前临床上治疗T-ALL的                       赖性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）、细胞周期
          化疗药物有长春新碱、柔红霉素、可的松和依托泊苷等，                           蛋 白 B1（Cyclin  B1）抗 体（批 号 分 别 为 ab133327、
          但上述药物具有高毒性和耐药性，这在一定程度上限制                            ab32072）均购自美国 Abcam 公司；兔源 Caspase-9、活化
          了其临床应用       [6―7] 。且有研究表明，这些化疗药物的耐                 的 Caspase-9（Cleaved  Caspase-9）、Caspase-3、活 化 的
          药性已成为T-ALL患儿复发的主要原因，严重影响患儿                          Caspase-3（Cleaved Caspase-3）、聚腺苷二磷酸-核糖聚合
          的预后 。因此，开发新型抗 T-ALL 的药物是临床迫切                        酶（poly  ADP-ribose  poly-merase，PARP）抗 体 和 Dy‐
                [8]
          需要的。                                                Light 800 标记的抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗均购自
                                                                  TM
              徐长卿 Cynanchum paniculatum （Bge.） Kitag. 为萝      美国Cell Signaling Technology公司。
          摩科鹅绒藤属多年生草本植物，以干燥根和根茎入药。                            1.3 细胞株
          其味辛，性温，归肝、肾经，具有祛风化湿、止痛止痒的功                              人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株购买于美国
                                                        [9]
          能，用于治疗风湿、牙痛、跌打伤痛、风疹、湿疹等病症 。                         ATCC细胞库，现于本实验室保存。
          现代药理研究表明，徐长卿具有抗菌、抗病毒、调节免                            2 方法
          疫、抗肿瘤等药理作用 。徐长卿中已报道的化学成分                            2.1 细胞培养
                             [10]
                                          [11]
          有168种，其中C21甾体类成分有47种 。本课题组前期                            将 Jurkat 细胞接种于含 5% 胎牛血清的 RPMI 1640
          对从徐长卿中提取分离得到的C21甾体化合物进行了抗                           培养基中，将细胞置于 37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培
          癌活性筛选，发现化合物XCQ-9具有抗人急性T淋巴细                          养，取对数生长期的细胞进行后续实验。
          胞白血病 Jurkat 细胞的作用，其结构式见图 1。本研究                      2.2 XCQ-9对细胞增殖的影响
          拟通过体外实验初步探索 XCQ-9 对 Jurkat 细胞增殖和                        采用 MTT 法进行检测。取对数生长期的 Jurkat 细
          凋亡的影响，并从经典的胱天蛋白酶（Caspase）途径和细                       胞，按1×10 个/孔接种于96孔板中，置于培养箱中常规
                                                                        5
          胞周期两个方面来考察其可能的作用机制，以期为将                             培养。待细胞稳定后，将其分为空白对照组（0 μmol/L）
          XCQ-9开发为治疗T-ALL的药物提供实验基础。                           和不同浓度（2.5、5、10、20、40 μmol/L，药物浓度根据前
                                     HO                       期预实验结果设置）的 XCQ-9 组，每组平行设置 5 个复
                                                              孔。分别干预 24、48、72 h 后，加入 10 μL 含 5 mg/mL 的
                                                              MTT 试剂常规孵育 4 h，然后再加入三联液（500 mL 三
                           O
                                                              联液中含十二烷基硫酸钠 50 g、异丁醇 25 mL 和浓盐酸
                       图1 XCQ-9的化学结构
                                                              0.5 mL）100 μL，孵育过夜。使用酶标仪测定各孔在
          1 材料                                                570 nm波长处的吸光度（A），计算细胞存活率[细胞存活
          1.1 主要仪器                                            率（%）＝（给药组 A/空白对照组 A）×100%]。实验重
              本研究所用的主要仪器有 A2 型生物安全柜（美国                        复3次。
          Thermo Fisher Scientific公司）、Microfuge 型台式高速冷        2.3 XCQ-9对细胞周期的影响
          冻离心机（美国Backman公司）、Axi Vert AL型倒置光学                      采用流式细胞术进行检测。取对数生长期细胞，按
                                                                   5
          显微镜（德国 Zeiss 公司）、Synergy2 型多功能酶标仪（美                 4×10 个/孔接种于 6 孔板中，常规培养。待细胞稳定
          国Gene公司）、PowerPac Basic型电泳仪（美国Bio-Rad               后，将其分为空白对照组（0 μmol/L）和不同浓度（2.5、5、
                               TM
          公司）、ACEA NovoCyte型流式细胞仪[艾森生物（杭州）                    10 μmol/L，浓度根据“2.2”项下 MTT 实验结果设置）的
          有限公司]、Odyssey&CLX 型双色红外成像系统（美国                      XCQ-9 组，每组平行设置 5 个复孔，置于培养箱中常规
          LI-COR Odyssey公司）。                                  培养。干预 24、48 h 后，以 1 000 r/min 离心 4 min，收集
          1.2 主要药品与试剂                                         细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入 500
              XCQ-9为本课题组提取制备，分子式为C21H30O2，纯                   μL预冷的70%乙醇固定过夜，再次以1 000 r/min离心4
                  [12]
          度≥98% ；胎牛血清购自美国 HyClone 公司；RPMI                     min 去除乙醇，并用预冷的 PBS 洗涤细胞；加入含 0.1

          · 48 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 1                                中国药房  2023年第34卷第1期
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