Page 48 - 《中国药房》2023年1期
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试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号分                            盒要求加入相应试剂检测其A值，再根据相应的标准曲
          别为E-AB-1004、E-IR-R308、E-CK-A362）。                   线计算对应生化指标的水平。
          2 方法                                                2.6 细胞形态观察
          2.1 八味沉香散含药血清的制备                                        选取八味沉香散中剂量（最佳药物浓度血清，下同）
                                                                            [11]
              将50只大鼠随机分为空白血清组（20只）和八味沉                        作为药物组浓度 ，按“2.3”项下所述方法对 H9c2 细胞
          香散低、中、高剂量组（每组10只），适应性饲养1周。根                         处理后，于倒置显微镜下观察细胞状态（如细胞壁结构、
          据药品说明书剂量和动物体表面积剂量换算公式换算，                            死亡细胞数量）并拍照。
          八味沉香散灌胃剂量为：低剂量2.5 g/kg，中剂量8 g/kg，                   2.7 细胞内ROS检测
          高剂量 12 g/kg（以每日人用剂量进行换算作为低剂量，                           选取八味沉香散中剂量作为药物组浓度，按“2.3”项
          以该剂量约3倍、5倍作为中、高剂量），空白血清组大鼠                          下方法对 H9c2 细胞分组与给药（n＝3）。按照 DCFH-
          灌胃等量生理盐水，每日 3 次，共 10 d。在末次给药 30                     DA ROS 试剂盒说明书方法进行染色，荧光显微镜下观
          min 后腹主动脉取血，于 4 ℃冰箱中静置 2 h，以 3 000                  察并通过流式细胞仪检测：收集各组细胞并用PBS洗涤
          r/min离心15 min，吸取血清，0.45 μm过滤器过滤、分装、                 2 次，结合缓冲液重悬后，加入 DCFH-DA 探针和适量
          封口、标记日期和编号，－80 ℃冰箱中保存备用。                            ROS供氢体，37 ℃孵育30 min后，分别用荧光显微镜和
          2.2 细胞培养                                            流式细胞术进行观察和检测H9c2心肌细胞氧糖剥夺损
              取 H9c2 细胞株，观察细胞形态是否异常，若无异                       伤后的 ROS 含量（绿色荧光强度越大，表示 ROS 含量
          常，于常氧培养箱（37 ℃、5％CO2 ）中适应环境，弃上清，                     越高）。
          PBS 洗 3 遍，消化细胞，培养基终止消化并吹打均匀，更                       2.8 细胞线粒体膜电位检测

          换新的培养皿继续培养。细胞融合度达 80% 左右开始                              选取八味沉香散中剂量作为药物组浓度，按“2.3”项
          实验。                                                 下方法对H9c2细胞分组与给药（n＝3）。按照JC-1试剂
          2.3 细胞分组、造模与给药                                      盒说明书方法进行染色，荧光显微镜下观察并通过流式
              待 H9c2 细胞生长至对数生长期时消化、计数并进                       细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位：收集各组细胞并用
          行培养，置于常氧培养箱（37 ℃、5％CO2 ）培养 24 h。将                   PBS 洗涤 2 次，结合缓冲液重悬后，加入 JC-1 工作液，
          细胞分为空白组、模型组和八味沉香散低、中、高剂量组                           37 ℃孵育 20 min 后，分别用流式细胞仪和荧光显微镜
         （含药血清剂量依次为 2.5、8、12 g/kg，剂量依据同“2.1”                  检测 H9c2 细胞氧糖剥夺损伤后线粒体膜电位情况（红
          项下）。空白组和模型组细胞培养液中加入20%的空白                           色荧光代表完整细胞膜，绿色荧光代表细胞膜破损）。
          血清，八味沉香散低、中、高剂量组细胞培养液中加入                            2.9 细胞凋亡检测
          20% 相应剂量的八味沉香散含药血清。空白组置于常                               选取八味沉香散中剂量作为药物组浓度，按“2.3”项
          氧培养箱（37 ℃、5％CO2 ）培养。模型组和八味沉香散                       下方法对 H9c2 细胞分组与给药（n＝3）。按照 Annexin
          低、中、高剂量组置于三气培养箱（2％O2 ）培养，待培养                        Ⅴ-FITC /PI 试剂盒说明书方法进行染色，荧光显微镜下
          箱内气体浓度达到缺氧条件时开始计时，缺氧时间为 8                           观察并通过流式细胞仪检测各组凋亡率：收集各组细胞
          h（此时若LDH释放量与空白组比较有显著性差异表示                           并用PBS洗涤2次，结合缓冲液重悬后，加入Annexin Ⅴ-
                                   [10]
          氧糖剥夺损伤模型建立成功） 。                                     FITC、碘化丙啶染色，37 ℃孵育 20 min 后，分别用流式
          2.4 细胞存活率检测                                         细胞仪和荧光显微镜检测细胞凋亡率（绿色荧光代表细
              采用 CCK-8 法检测。H9c2 细胞接种于 96 孔板中，                 胞早期凋亡，红色荧光代表细胞晚期凋亡）。
          按“2.3”项下方法分组与给药。缺氧结束后，各组细胞加                         2.10 细胞氧化应激和凋亡相关蛋白的检测

          入 CCK-8 溶液（总体积的 10％）并孵育（37 ℃）1 h，用酶                     选取八味沉香散中剂量作为药物组浓度，按“2.3”项
          标仪检测450 nm 波长处吸光度（A）值，按试剂盒说明书                       下方法对H9c2细胞分组与给药（n＝3）。提取各组细胞
          方法计算细胞存活率（n＝6）。                                     总蛋白，用 BCA 试剂盒进行定量。各组蛋白上样量 10
          2.5 细胞生化指标检测                                        μL，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移
              按“2.3”项下方法对 H9c2 细胞分组与给药，缺氧结                    至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭，然后加入一抗
          束后，每孔吸出细胞上清液作为待测样品（n＝6）。按                          （Keap1、Nrf2、Ndufa10、HO-1、Trx、Bcl-2、Cytc、Bax、β-actin
          LDH、CK、CAT、MDA、SOD、GSH-Px 和 ComplexⅠ试剂              和Caspase-3，稀释度均为1︰1 000）4 ℃孵育过夜，PBS洗


          · 42 ·    China Pharmacy  2023 Vol. 34  No. 1                                中国药房  2023年第34卷第1期
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