Page 74 - 《中国药房》2022年21期

对 H1N1 病毒 NP 基因 mRNA 的相对表达量进行检测。 上清。以上实验均在BSL-2实验室中进行。
qRT-PCR程序设定如下：50 ℃反转录20 min；95 ℃预变 2.3.2 小鼠鼻腔和肺部细菌载量测定 取哥伦比亚血
性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸20 s，总共40个 平板若干，每个平板等分成3个区，取“2.3.1”项下鼻腔灌
循环。以 GAPDH 为内参，采用 2 －ΔΔCt 法分析 NP 基因 洗液和肺组织匀浆上清液各 10 μL，分别接种于血平板
mRNA 的相对表达量，以 NP 基因 mRNA 的相对表达量 上，每个样本做3个重复位点。接种完毕后，先将血平板
来反映病毒载量。引物由北京擎科生物科技有限公司 正置于细菌培养箱中培养 0.5 h，再倒置培养 16 h，然后
[2]
设计并合成，引物序列及扩增产物大小见表1。 进行菌落计数 。
表1 引物序列及扩增产物大小 2.3.3 小鼠血清中 IFN-β、IL-17、IL-23 水平测定 取
基因名称 引物序列（5′→3′） 扩增产物大小/bp “2.3.1”项下血清，采用ELISA法检测小鼠血清中IFN-β、
NP 上游：GTATGGACCTGCCGTAGC 227 IL-17、IL-23水平，具体操作按相应试剂盒说明书进行。
下游：GCTTCCACGAGGGTTCTC 2.4 统计学方法
GAPDH 上游：GGATGCTGCCCTTACCC 183
下游：GCCTGGCTTGTGTACC 采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。符合正
2.1.3 小鼠肺组织病理学观察 取“2.1.1”项下经4%多 态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方
聚甲醛固定后的肺组织，常规制备石蜡切片（厚度 5 差分析，方差齐时组间两两比较采用LSD-t检验，方差不
μm），行HE染色，在光学显微镜下观察并拍照。 齐时组间两两比较采用 Dunnett’s T3 检验。检验水准
2.1.4 小鼠血清中炎症细胞因子检测 取“2.1.1”项下 α＝0.05。
血清，采用 ELISA 法测定各组小鼠血清中 TNF-α、IL- 3 结果
1β、IL-6 的水平，具体操作按对应试剂盒说明书方法 3.1 金贝口服液抗小鼠甲型H1N1流感病毒作用
进行。 3.1.1 小鼠体质量及肺指数测定结果 由小鼠体质量
2.2 金贝口服液对继发性肺炎链球菌感染小鼠死亡的 变化率可知：自造模第4天起，除空白组外，其余各组小
保护作用研究 鼠的体质量均有明显的下降趋势。造模第6天时，与空
将 48 只小鼠按随机数字表法分为 6 组，每组 8 只， 白组比较，模型组小鼠的体质量显著降低（P＜0.05），肺
分别为空白组、细菌单感染组、病毒单感染组、病毒-细 指数显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各给药组小鼠
的体质量均显著升高（P＜0.05），肺指数均显著降低
菌共感染组、磷酸奥司他韦胶囊组（阳性对照组，25.6
（P＜0.05）。结果见图1。
mg/kg，为成人临床等效剂量）和金贝口服液组（15.6
mL/kg）。将小鼠适应性饲养 5 d 后，除空白组和细菌单 110 Ⅰ 2.0
Ⅱ
感染组小鼠滴鼻20 μL生理盐水外，其余各组小鼠均滴 100 Ⅲ 1.5 a
Ⅳ
Ⅴ
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鼻含0.5个LD50的H1N1病毒液20 μL 。造模2 h后，以 体质量变化率/％ 90 b b b b Ⅵ b b b
小鼠灌胃容积 0.1 mL/10 g 为标准，空白组、细菌单感染 80 a 肺指数/％ 1.0 b
组、病毒单感染组、病毒-细菌共感染组小鼠均灌胃蒸馏 70 0.5
水，给药组小鼠灌胃对应药液，每日 1 次，连续灌胃 6 d。 60
0 2 4 6 8 0
第 6 天灌胃 2 h 后，空白组和病毒单感染组小鼠滴鼻 50 时间/d Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
A.体质量变化率 B.肺指数
9
μL 无菌蒸馏水，其余各组小鼠均滴鼻含 1×10 个菌落
Ⅰ：空白组；Ⅱ：模型组；Ⅲ：磷酸奥司他韦胶囊组；Ⅳ：金贝口服液
形成单位（colony forming unit，CFU）的肺炎链球菌液50 高剂量组；Ⅴ：金贝口服液中剂量组；Ⅵ：金贝口服液低剂量组；a：与空
μL [2，9] 。每日继续按上述方法灌胃并监测小鼠体质量， 白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
直至病毒滴鼻后的第14天。 图1 金贝口服液对病毒感染小鼠体质量变化率和肺指
2.3 金贝口服液抗继发性肺炎链球菌感染作用研究 数的影响（x±s，n＝8）
2.3.1 分组、造模、给药与取样 将 48 只小鼠按随机数 3.1.2 小鼠肺病毒载量测定结果 与空白组（NP 基因
字表法分为6组，每组8只，分组、造模、灌胃方式等均同 mRNA的相对表达量为0.09±0.02）比较，模型组小鼠的
“2.2”项下。肺炎链球菌感染24 h后，将小鼠摘眼球取血 肺病毒载量（NP 基因 mRNA 的相对表达量为 1.08±
（按“2.1.1”项下方法制备血清）并处死，然后于超净工作 0.46）显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，磷酸奥司他
台中暴露其颈部气道，利用18G静脉留置针进行鼻腔灌 韦胶囊组和金贝口服液高、中剂量组的肺病毒载量（NP
洗，每次注入0.2 mL无菌水，收集灌洗液至1.5 mL EP管 基因 mRNA 的相对表达量分别为 0.59±0.27、0.70±
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中 。同时，于无菌环境下取小鼠肺组织，称质量后计算 0.35、0.71±0.13）均显著降低（P＜0.05），金贝口服液低
小鼠肺指数（计算公式同“2.1.1”项下）。将肺组织置于 剂量组小鼠的肺病毒载量（NP 基因 mRNA 的相对表达
组织研磨机中制备匀浆，以 1 000 r/min 离心 3 min 后取 量为0.99±0.13）差异无统计学意义（P＞0.05）。

·2624· China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 21 中国药房 2022年第33卷第21期