Page 29 - 《中国药房》2022年19期
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结肠癌是一种高异质性疾病，尽管其早期患者可以                         2 方法
          通过手术和辅助方案治疗，但治疗后仍有部分患者容易                           2.1 细胞培养
          复发  [1―2] ，且大多数患者在诊断时已经处于中晚期阶段，                        将 HT29 细胞或 HCT116 细胞培养于含 10% 胎牛血
          常规疗法已经很难有效          [3―4] ，亟需寻找新的有效治疗方             清的 McCoy’s 5A 完全培养基中，置于 37 ℃、5% CO2培
          案。目前，结肠癌细胞的高转移特性是导致结肠癌预后                           养箱中培养。
          不良的主要原因，其中上皮间质转化（epithelial-mesen-                 2.2 毛萼乙素对结肠癌细胞迁移能力的影响
          chymal transition，EMT）是肿瘤转移的重要因素。因此，                   将 6 孔板背面用记号笔画 3 条横穿过孔的直线，然
          开发可有效抑制结肠癌细胞EMT的药物尤为重要。                            后将 HT29 或 HCT116 细胞以 1.5×10 个/孔接种于 6 孔
                                                                                             5
              毛萼乙素是从疏花毛萼香茶菜中提取的一种具抗                          板中，待细胞完全贴壁后，使用枪头在细胞生长面垂直
          癌活性的二萜类化合物，已有报道显示，其在急性髓系                           于背后直线划痕，并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗掉落的
                [5]
                        [6]
                                [7]
          白血病 、乳腺癌 、胰腺癌 等恶性肿瘤中发挥了较好的                         细胞。将上述2种细胞分为对照组和毛萼乙素不同浓度
          治疗作用，但其是否可用于治疗结肠癌尚不明确。目前                           组（1.0、1.5 μmol/L，浓度参考文献[5]设置），每组设 3 个
          已有研究发现，异常的 Wnt/β-联蛋白（β-catenin）激活可                 复孔。培养 0、24、48 h 后，采用倒置显微镜观察划痕的
          直接驱动结肠癌的进展和转移             [8―10] ，但毛萼乙素是否可         愈合情况，并拍照。采用Image J v1.8.0软件测量划痕的
          通过该信号通路治疗结肠癌尚不明确。基于此，笔者以                           距离，计算细胞迁移率[细胞迁移率＝（0 h划痕宽度－不
          结肠癌细胞 HT29、HCT116 为研究对象，探讨毛萼乙素                     同时间点划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%]。
          对上述2种细胞侵袭、迁移的影响，并基于Wnt/β-catenin                   2.3 毛萼乙素对结肠癌细胞侵袭、迁移的影响
          信号通路初探毛萼乙素对结肠癌细胞 EMT 的作用，以                         2.3.1  Transwell 侵袭实验     取对数生长期的 HT29、
          期为毛萼乙素治疗结肠癌提供实验依据。                                 HCT116细胞，制成细胞密度为5×10 mL 的无血清细
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          1 材料                                               胞悬液，分别给予 0（对照组）、1.0 μmol/L（浓度根据
          1.1  主要仪器                                         “2.2”项下实验结果设置，下同）的毛萼乙素刺激，每组设
              本研究所用主要仪器有TS100F型荧光倒置显微镜                       置 3 个复孔。取上述细胞悬液 200 μL 加到 Transwell 小
         （日本 Nikon 公司）、DMi8 型倒置显微镜（德国 Leica 公                室上层，下层中加入含 20％胎牛血清的 McCoy’s 5A 培
          司）、810FUGE 型低温高速离心机（美国 Thermo Fisher               养基600 μL。将细胞侵袭小室置于培养箱中培养24 h，
          Scientific公司）、TD-5Z型台式低速多管架离心机（四川                  然后以 4％多聚甲醛固定 30 min，再用 1％结晶紫染色
          蜀科仪器有限公司）、DYY-6D 型电泳仪（北京六一生物                       30 min后，于倒置显微镜下观察穿过基底膜的侵袭细胞
          科技有限公司）、Gel Doc XR 全自动凝胶成像系统（上海                    数。每个样本观察 5 个视野，取平均值作为检测结果。
                                  +
          艾研生物科技有限公司）等。                                      实验重复 3 次，然后计算细胞侵袭率[细胞侵袭率＝（对
          1.2  主要药品与试剂                                       照组侵袭数－实验组侵袭数）/对照组侵袭数×100%]。
              毛萼乙素（货号84745-95-9）购自云南西力生物技术                   2.3.2  Transwell 迁移实验    实验前，在 Transwell 小室
          股份有限公司；Licl（Wnt/β-catenin 信号通路激活剂）购                内膜上均匀铺入稀释后的Matrigel 50 μL，待其凝结后，
          自北京伊诺凯科技有限公司（货号 A53473）；XAV939                     取对数生长期的 HT29、HCT116 细胞，制成细胞密度为
         （Wnt/β-catenin信号通路抑制剂）购自美国MCE公司（货                   1×10 mL 的无血清细胞悬液，分别给予 0（对照组）、
                                                                      －1
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          号284028-89-3）；兔源原癌基因蛋白质c-myc、N-钙黏蛋                 1.0 μmol/L 的毛萼乙素刺激，每组设置 3 个复孔。其余
          白（N-cadherin）、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、β-catenin、T细      操作同“2.3.1”项，然后计算细胞迁移率[细胞迁移率＝
          胞因子 4（TCF4）、细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）、锌指转              （对照组迁移数－实验组迁移数）/对照组迁移数×
          录抑制因子 Snail、β-肌动蛋白（β-actin）均购自山东华安                 100%]。
          生物科技有限公司（货号分别为 HA721182、ET107-37、                  2.4 毛萼乙素对结肠癌细胞中EMT相关蛋白表达的影响
          ET1607-15、ET1601-5、R1401-11、ER0722、EM1706-65、          采用 Western blot 法进行实验。取 HT29 细胞或
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          ET1701-80）；羊抗免疫球蛋白 G 二抗购自美国 Sigma 公                HCT116细胞按2×10 个/孔接种于6孔板后分为对照组
          司（货号A6154）；ECL化学发光试剂购自上海雅酶生物                       和毛萼乙素 0.5、1.0、1.5 μmol/L 组。培养 24 h 后，收集
          科技有限公司（货号SQ201）；McCoy’s 5A培养基、胎牛                   细胞，加入RIPA裂解液裂解20 min，离心，取上清液，经
          血 清 购 自 美 国 Gibco 公 司（货 号 分 别 为 16600108、          BCA法检测蛋白浓度后，进行变性、十二烷基硫酸钠-聚
          10100147）。                                         丙烯酰胺凝胶电泳和转膜；以 5% 脱脂奶粉溶液封闭 1
          1.3  细胞                                            h，PBST 缓冲液清洗 5 min×3 次后，加入 E-cadherin、N-
              结 肠 癌 细 胞 HT29、HCT116 购 自 中 国 科 学 院 细          cadherin、Snail、β-actin 一抗（稀释度均为 1∶500）孵育过
          胞库。                                                夜；以 PBST 缓冲液清洗 5 min×3 次，加入二抗（稀释度


          中国药房    2022年第33卷第19期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19  ·2327·
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