Page 73 - 《中国药房》2022年16期
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肺癌是全球病死率最高的恶性肿瘤，其死亡人数占                         2 方法
        所有癌症死亡人数的18％ 。5-氟尿嘧啶（5-fluoruracil，                2.1 Irb对细胞增殖活力的影响考察
                              [1]
        5-FU）是一种常用且经典的化疗药物，可通过抑制胸苷                             取对数生长期的 Lewis 肺癌细胞，用培养基稀释至
        酸合成酶阻滞DNA合成，从而发挥抗肿瘤活性，临床常                          1×10 个/mL，吸取200 μL接种于96孔板中，用不同浓度
                                                                5
        用于各种实体恶性肿瘤的治疗。然而，5-FU在使用中存                         （0、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10    －1  mmol/L ）的
                                                                   －5
                                                                                －3
                                                                          －4
                                                                                                       [5]
                                                                                       －2
        在耐药性和中枢神经毒性等毒副作用，限制了其临床应                           Irb处理细胞，孵育48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，避
        用 。因此，寻找协同增效或削弱5-FU毒性的药物是目                         光孵育 4 h 后，去除培养基，再加入二甲基亚砜 200 μL，
          [2]
        前研究的热点。                                            用酶标仪在 570 nm 波长处检测光密度（optical density，
            厄贝沙坦（irbesartan，Irb）是一种血管紧张素Ⅱ受体                OD），以OD值评价细胞增殖活力。
        阻滞剂，具有抗氧化、抗炎、抗纤维化及抗肿瘤等特性，                          2.2 细胞分组与给药
        可通过调节机体内炎症因子的释放，发挥心脏保护作                                取对数生长期的Lewis肺癌细胞，分为正常对照组、
          [3]
        用 。已有研究表明，Irb与化疗药物表柔比星联用可削                         Irb 低浓度组（1×10    －3  mmol/L，根据“2.1”项下实验结果
                     [4]
        弱后者的毒性 ，亦可通过抑制胞外信号调节激酶 1/2                         设置）、Irb 高浓度组（1×10      －1  mmol/L，根据“2.1”项下实
       （extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）的 磷  验结果设置）、5-FU组（10 μmol/L ）、Irb低浓度+5-FU组
                                                                                        [8]
        酸化（即成为 p-ERK1/2）来阻滞乳腺癌 MCF-7 细胞的                   （Irb 1×10  － 3  mmol/L+5-FU 10 μmol/L）和 Irb 高浓度+
        增殖 ，还可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ                           5-FU组（Irb 1×10 －1  mmol/L+5-FU 10 μmol/L），除正常对
            [5]
       （peroxisome proliferater activated receptor gamma，PPARγ）  照组细胞正常培养外，其余5组细胞使用相应浓度的Irb
        来诱导细胞自噬        [6－7] 。基于此，本研究考察了 Irb 联合            或（和）5-FU培养24 h。
        5-FU 对 Lewis 肺癌细胞增殖及 ERK/PPARγ信号通路的                2.3  Irb联合5-FU对细胞增殖活力的影响考察
        影响，以期为临床肺癌治疗方案的优化提供参考。                                 按“2.1”项下方法检测“2.2”项下各组细胞培养24 h
        1 材料                                               后的细胞增殖活力。

        1.1  主要仪器                                          2.4  Irb联合5-FU对细胞集落形成数的影响考察
            本研究所用的主要仪器包括 Miulab GIS-500 型凝                     取按“2.2”项下方法分组、给药处理 18 h 后的细胞，
        胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）、DMI 3000B型倒置                      制备成单细胞悬液。取单细胞悬液1 mL（细胞密度200
        显微镜（德国Leica公司）、BB150-2TCS型CO2细胞培养                  个/mL）铺于 6 cm 培养皿中，于 37 ℃、5％CO2条件下培
        箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）等。                  养 1～2 周，每天更换 1 次培养基，直至出现肉眼可见的
        1.2  主要药品与试剂                                       细胞增殖时终止培养，除去培养基，使用磷酸盐缓冲液
            Irb（批号T1615，纯度99％）购自南京赛泓瑞生物科                   浸洗2～3次，干燥后加入甲醇固定15 min，去除甲醇，晾
        技有限公司；5-FU（货号V900394-1G，纯度98％）购自美                  干后，使用Giemsa液染色10 min，洗去染料，干燥后在显
        国 Sigma 公 司 ；蛋 白 酶 抑 制 剂 苯 甲 基 磺 酰 氟（批 号           微镜下拍照记录细胞集落形成数（按细胞数＞50 个、直
        HY-B0796）购自美国Med Chem Express公司；MTT溶液              径0.3～1.0 mm为1个集落）。实验重复3次。
       （批号 CS2905）购自北京博奥森生物技术有限公司；                         2.5  Irb 联 合 5-FU 对 细 胞 中 PCNA、p53、ERK1/2、
        Giemsa 液（批号 G1010-500）购自北京索莱宝科技有限                  p-ERK1/2、PPARγ蛋白表达的影响考察
        公司；通用型 Bradford 蛋白定量试剂盒（批号 E211-01）                    采用Western blot法进行检测。取按“2.2”项下方法
        购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；兔增殖细胞核                           分组、给药处理 24 h 后的细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液
        抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、肿瘤抑制   冲洗 2～3 次，加入含苯甲基磺酰氟的 RIPA 裂解液，在
        蛋 白 p53、ERK1/2、p-ERK1（T202）+ p-ERK2（T185）、         4 ℃下裂解 30 min后以 15 000×g 离心 20 min，分离上清
        PPARγ、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos-           液即为总蛋白，测定蛋白浓度，加上样缓冲液煮沸 15
        phate dehydrogenase，GAPDH）单克隆抗体及辣根过氧               min变性，置于－20 ℃冰箱备用。每孔上样蛋白50 μg，
        化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（H&L）二抗（批号                         使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到聚偏二氟乙
        分 别 为 ab92552、 ab32389、 ab184699、 ab201015、        烯膜上，用 TBST 缓冲液冲洗 3 次，加入 5％牛血清白蛋
        ab178860、ab181602、ab6721）均购自英国Abcam公司。             白（用 TBST 缓冲液稀释）室温封闭 2 h，加入 PCNA、
        1.3  细胞                                            p53、ERK1/2、p-ERK1（T202）+p-ERK2（T185）、PPARγ和
            小鼠Lewis肺癌细胞购自美国ATCC生物标准品资                      GAPDH一抗（稀释比例均为 1 ∶ 500），低温孵育过夜；用
        源中心，货号AC-2654H。                                    TBST缓冲液冲洗3次，加入二抗（稀释比例为1∶5 000），


        中国药房    2022年第33卷第16期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 16  ·1987 ·
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