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余各组大鼠股静脉注射环磷酰胺（75 mg/kg）1 mL 复制                     2.8 卵巢组织中HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA表达检测
        DOR 模型 。注射结束 24 h 后根据阴道脱落细胞切片                           采用实时定量 PCR 法检测。取各组大鼠部分卵巢
                 [12]
        观察大鼠动情周期情况，动情周期≥6 d 或停滞在某一                          组织于匀浆器中，加入 TRIzol试剂提取总 RNA，按逆转
        时期≥3 d 者，视为动情周期紊乱，表示 DOR 造模成                        录试剂盒说明书要求，将提取的总RNA逆转录成cDNA，
        功。造模成功 2 h 后，加减益经汤低、中、高剂量组大                         再进行扩增。引物采用PyroMark Assay Design 2.0软件
        鼠灌胃加减益经汤（5.9、11.8、23.6 g/kg） ，抑制剂组                  设计，由美国 Thermo Fisher Scientific 公司合成，引物序
                                            [13]
        大 鼠 灌 胃 加 减 益 经 汤 23.6 g/kg 并 同 时 股 静 脉 注 射         列和产物长度见表1。以β-actin为内参，采用2               －ΔΔCT 法计
        YC-1（2 mg/kg），阳性对照组大鼠灌胃戊酸雌二醇片                       算HIF-1α、Bnip3、Beclin1 mRNA的相对表达量。
                                                                        表1 引物序列和产物长度
        0.09 mg/kg，对照组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，
        每日给药1次，连续8周。                                         基因     引物序列                             产物长度/bp
                                                             HIF-1α  上游引物：5′-TCCAAGAAGCCCTAACGTGT-3′   295
        2.3 动情周期观察                                                  下游引物：5′-TTGTCTTTTGCTCCATTCCA-3′
            药物干预 24 h 后，以生理盐水湿润消毒棉签后，插                       Bnip3  上游引物：5′-CCACCTCGCTCGCAGACACCAC-3′  317
                                                                    下游引物：5′-GAGAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3′
        入大鼠阴道深约 0.5 cm，旋转一周，将棉签上的分泌物
                                                             Beclin1  上游引物：5′-GCTGGAAGATGTGGAAAAGAA-3′  137
        均匀涂抹于载玻片并晾干，滴加多聚甲醛固定 15 min，                                下游引物：5′-AAGGTGGCATTGAAGACATTG-3′
        苏木精浸染5 min，盐酸乙醇分化10 s，伊红染色20 s，流                     β-actin  上游引物：5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′  465
                                                                    下游引物：5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′
        水冲洗后干燥封片，在显微镜下观察脱落细胞形态，评
                                                            2.9 统计学方法
        价各组大鼠动情周期变化。
                                                                使用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。符合
        2.4  卵巢指数和病理学观察
                                                            正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因
            药物干预结束后，各组大鼠称定质量后禁食 12 h，
                                                            素方差分析，事后比较采用 LSD-t 检验。检验水准α＝
        麻醉后剪开腹腔，分离卵巢并称定质量，计算卵巢指
                                                            0.05。
        数[卵巢指数＝卵巢湿质量（mg）/体质量（g）×100％]，然
                                                            3 结果
        后将大鼠部分卵巢组织制成石蜡切片，采用苏木精-伊
                                                            3.1  大鼠动情周期比较
        红染色后，在显微镜下观察其病理学变化。
                                                                对照组大鼠表现出规律的动情周期；模型组和抑制
        2.5  卵巢细胞自噬情况观察
                                                            剂组大鼠动情周期均出现紊乱，主要表现为不同程度的
            取大鼠病理学观察剩余的部分卵巢，去除周围脂肪
                                                            动情周期延长，每次5～9 d，甚至未见完整的动情周期；
        组织，低倍镜下用 25 号针头刺破卵泡，分离卵母细胞
                                                            阳性对照组和加减益经汤各剂量组大鼠动情周期恢复
        和颗粒细胞，吹打使细胞分离，200 目网筛过滤，以 800                       正常，每次4～5 d。实验结束时，模型组有41.6％的大鼠
        r/min 离心 10 min，弃上清，收集细胞。24 h 后细胞消化                 停止动情8 d后自然恢复正常动情周期，58.4％的大鼠未
        后爬片，用乙醇及丙酮脱水，环氧树脂浸透、包埋，切片                           能恢复正常动情周期。
        （厚 50～60 nm），以醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，于                      3.2  大鼠卵巢指数比较
        透射电镜下观察自噬情况。                                            如图1所示，相较于对照组大鼠，模型组和各给药组
        2.6  血清激素水平检测                                       大鼠卵巢指数均显著降低（P＜0.05）；相较于模型组大
            抽取各组大鼠腹腔主动脉血5 mL，以3 000 r/min离                  鼠，阳性对照组和加减益经汤各剂量组大鼠卵巢指数均
        心15 min，取上清液，按ELISA试剂盒方法，检测血清中                      显著升高（P＜0.05）。
        FSH、LH、AMH、E2水平。                                      60
        2.7 卵巢组织中HIF-1α、Bnip3、Beclin1蛋白表达检测
                                                                                                 ab   ab
            采用 Western blot 法检测。取各组大鼠部分卵巢组                                      ab    a    ab
                                                              40           a
        织，提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，加热变性5
        min 后，取部分变性后的蛋白样品，用十二烷基硫酸钠-                           卵巢指数/％
        聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜                             20
        上，在室温下用 5％脱脂奶粉封闭 1 h，加入 HIF-1α、
        Bnip3、Beclin1、β-actin 一抗（稀释比例均为 1 ∶ 1 000），
                                                               0
        4℃孵育过夜；用 TBST 缓冲液洗涤 3 次，加入 HRP 标记
                                                                   对照组   模型组   阳性对   抑制   加减益   加减益  加减益
                                                                               照组    剂组   经汤低   经汤中  经汤高
        的二抗（稀释比例为 1 ∶ 5 000），室温下孵育 1 h，显色显                                                剂量组   剂量组  剂量组
        影，通过 Image J v1.8.0 软件分析，以目标蛋白与内参蛋                     a：与对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
        白（β-actin）灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。                           图1 各组大鼠卵巢指数的比较（x±±s，n＝20）


        ·1732 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 14                                 中国药房    2022年第33卷第14期
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