Page 128 - 《中国药房》2022年12期
P. 128

1 酶水解法制备淫羊藿低糖苷类化合物                                  步骤的同时，提高了反应效率，避免了后续烦琐的分离
            已有大量文献报道，淫羊藿苷、朝霍定 A、朝霍定 B                       纯化过程；同时，该工艺对设备要求低，比较适合于大规
        和朝霍定 C 可被蜗牛酶依次水解为宝藿苷Ⅰ或淫羊藿                           模的工业化生产。
        苷元、箭藿苷A、箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，淫                               α-L-鼠李糖苷酶可特异性地作用于α-1，2、α-1，3、
        羊藿苷可被纤维素酶转化为宝藿苷Ⅰ                  [10－13] 。上述方法     α-1，4、α-1，6糖苷键，通过除去α-L-鼠李糖基来获得新的
        可用于制备淫羊藿低糖苷类化合物，但存在酶不能重复                            糖苷类化合物 。研究表明，在最优酶水解条件下，朝
                                                                         [26]
        利用的问题，导致生产成本较高，故并不适用于工业化                            藿定 C 可被α-L-鼠李糖苷酶特异性水解脱去 C3 位上的
                                            [14]
        生产。为了进一步改善上述问题，彭静等 以海藻酸钡                            鼠李糖基转化为淫羊藿苷，但只有在底物浓度为 100～
        为载体，通过交联-包埋法对蜗牛酶进行固定，以朝藿定                           200 μg/mL 的条件下才能实现完全水解            [27－28] 。Lyu 等 [29]
        A、朝藿定 B、朝霍定 C 和淫羊藿苷为底物进行水解，水                        研究发现，在大肠埃希菌中表达的重组α-L-鼠李糖苷酶
        解转化率可达 75.52％；经 5 次重复使用后，固定化蜗牛                      可使朝藿定C高效转化为淫羊藿苷，在最优水解条件下
        酶的活性还可保持在原来的50％，表明该工艺在通过酶                           底物浓度有所提高但也只能达到1 mg/mL，且酶不能重
        水解制得低糖苷类化合物的同时，实现了对酶的重复利                            复利用。该研究也同样证实了α-L-鼠李糖苷酶对淫羊藿
        用，但存在载体机械强度低、在高温和酸性条件下长时                            黄酮苷C3位鼠李糖基的高选择性。由此可见，α-L-鼠李
                                                [15]
        间搅拌容易吸水溶胀甚至破裂等不足。Liu等 改善了                           糖苷酶主要作用于淫羊藿黄酮苷类化合物C3位上的鼠
        酶的固定化方法，以二氧化硅为载体固定蜗牛酶，在水                            李糖基，将朝藿定 C 水解为淫羊藿苷。目前，该工艺仍
        解淫羊藿苷和总黄酮时，酶重复利用 6 次后，仍保持了                          处于实验室研究阶段，通过该酶水解淫羊藿多糖苷类化
        60％的酶活力，其pH和热稳定性、底物浓度及酶稳定性                          合物来制备低糖苷类化合物，还需进一步通过酶工程等
        均得到了较好的提升；同时该研究还发现，淫羊藿总黄
                                                            技术构建高效的水解体系，解决水解效率低和酶重复利
        酮的水解产物具有明显的抗肿瘤作用。
                                                            用性差等问题。
            蜗牛酶中含有大量的纤维素酶，而纤维素酶的主要
                                                                综上，淫羊藿苷和朝藿定 A、朝藿定 B、朝藿定 C 可
        成分为β-葡萄糖苷酶，后者能够水解β-葡萄糖苷键，通过
                                                            分别被不同的酶水解为宝藿苷Ⅰ或苷元、箭藿苷 A、箭
                                         [16]
        除去β-葡萄糖基来获得剩余黄酮母核 。因此，β-葡萄
                                                            藿苷B和淫羊藿苷或鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，其水解途
        糖苷酶很可能是纤维素酶和蜗牛酶水解淫羊藿黄酮苷
                                                            径及产物见图1。
        C7位葡萄糖基的主要作用酶。研究表明，纤维素酶和β-                          2 微生物转化法制备淫羊藿低糖苷类化合物
        葡萄糖苷酶均可将淫羊藿苷水解为宝藿苷Ⅰ，但低浓度
                                                                微生物细胞中存在的酶种类较多，且具有较好的糖
        纤维素酶的专一性较差，容易生成副产物；而β-葡萄糖
                                                                               [30]
                                                            苷类化合物转化潜力 。经发酵转化后脱去的糖可作
        苷酶的水解率和定向转化率均接近 100％，具有较高的
                                                            为微生物生长繁殖所需的碳源，从而代谢生成更多的
        效率和较强的专一性。这基本证明了β-葡萄糖苷酶是
                                                            酶，因此微生物发酵法也被广泛应用于多糖苷类化合物
        水解淫羊藿黄酮苷 C7 位葡萄糖基的主要作用酶                    [17－20] 。
                                                                          [31]
                                                            的结构修饰领域 。
                 [21]
        刘聪燕等 以壳聚糖交联介孔纳米二氧化硅为载体进
                                                                研 究 表 明 ，短 刺 小 克 银 汉 霉 菌 Cunninghamella
        行β-葡萄糖苷酶的固定，并将该酶重复用于淫羊藿苷的
                                                            blakesleana、平菇 Pleurotus ostreatus、链球菌 Streptococcus
        高效水解以制备宝藿苷Ⅰ，该研究也同样证实了β-葡萄
                                                            sp. MRG-ICA-B、肠球菌 Enterococcus sp. MRG-ICA-E、
        糖苷酶对淫羊藿黄酮苷C7位葡萄糖基的高选择性和水
        解的高效性。淫羊藿多糖苷类化合物在被β-葡萄糖苷                            布劳特氏菌 Blautia sp. MRG-PMF-1 及大鼠肠道菌群均
        酶水解的过程中会脱去 C7 位上的葡萄糖基，故在水解                          可将淫羊藿黄酮苷类化合物母核C7位上的葡萄糖基水
        完成后会生成低糖苷类化合物和葡萄糖。为了进一步                             解代谢，生成含有鼠李糖基的次级苷类化合物，如短刺
        获得纯度较高的低糖苷类化合物，避免后续烦琐的分离                            小克银汉霉菌可将朝藿定 A、朝藿定 B、朝霍定 C、淫羊
        纯化操作，提高反应效率及节约成本，汪燕等 和 Shen                         藿苷及淫羊藿苷A依次代谢为箭藿苷A、箭藿苷B、鼠李
                                                [22]
        等 [23－25] 构建了清洁、高效的新型双相酶水解体系，该体                     糖基淫羊藿次苷Ⅱ、宝藿苷Ⅰ及宝藿苷Ⅱ，其中大鼠肠
        系集水解、分离纯化为一体，基于脂溶性有机溶剂与缓                            道菌群不仅可将淫羊藿苷水解为宝藿苷Ⅰ，而且可把具
        冲液互不相溶且产物更易溶于有机溶剂的特点，以乙酸                            有与宝藿苷Ⅰ相同母核结构的化合物转化为宝藿苷Ⅰ；
        乙酯为有机相，以β-葡萄糖苷酶、底物和缓冲液等为水                           平菇发酵液可将淫羊藿苷A代谢生成宝藿苷Ⅱ；淫羊藿
        相，在短时间内将高浓度的黄酮苷类化合物淫羊藿苷、                            苷与链球菌、肠球菌孵育后仅生成了宝藿苷Ⅰ，提示上
        朝藿定A和朝藿定B分别水解为相应产物（转化率均在                            述两种菌对淫羊藿黄酮苷类化合物母核C7位上的葡萄
                                                                                                   [36]
        98％以上，有机相转移率超过95％），反应结束后将有机                         糖基具有较好的区域选择性              [32－35] 。Cheng 等 和杨宇
        层浓缩干燥，即可获得高纯度的低糖苷类化合物，同时                            等 分别对绿色木霉 Trichoderma viride 和柱孢梨头霉
                                                              [37]
        缓冲液中的酶可被多次重复利用。该工艺在简化操作                             菌 Absidia sp. E9r 的菌株进行发酵培养，发现两者均可


        ·1526 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 12                                 中国药房    2022年第33卷第12期
   123   124   125   126   127   128   129   130   131   132   133