Page 51 - 《中国药房》2022年11期
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种常             亚砜（DMSO，天津市风船化学试剂科技有限公司，批号
        见的渐行性中枢神经系统退行性疾病，患者大脑中普遍                           20210415），蛋白胨、琼脂粉（北京奥博星生物技术有限
        呈现脑组织萎缩、老年斑、神经元纤维缠结等病理特                            公司，批号分别为20190126、20191030），酵母浸粉（美国
        征 。全球AD患者正逐年递增，目前临床上也缺乏能有                          Oxoid 公司，批号分别为 1267856-03），Trizol 试剂（美国
          [1]
                       [2]
        效治疗AD的药物 。                                         Ambion Life 公司，批号 204202），TB Green   TM  Premix Ex
            沙利度胺是一种新型的免疫调节药和抗炎药，可抑                         Taq TM  Ⅱ、PrimeScript TM  RT reagent Kit with gDNA Eraser
        制单核细胞和巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α（tumor                          （日 本 Takara 公 司 ，批 号 分 别 为 RR820A、RR047A）。
        necrosis factor-α，TNF-α），从而减少淀粉样蛋白的形成；             Gsk-3、Age-1、Akt-1、Clp-1 基因（钙蛋白酶的同源基因）
        其还能抑制白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6            的引物由深圳华大基因科技有限公司设计并合成（PCR
        等炎症因子的产生 。相关研究发现，上述炎症因子可                           引物序列及扩增产物长度见表 1）。其余试剂为实验室
                        [3]
        参与 Tau 蛋白的过度磷酸化，加快 Tau 蛋白病理形成的                     常用规格，水为纯净水。
        过程  [4－5] 。                                                表1 PCR引物序列及扩增产物长度
            Tau 蛋白的病理变化与 AD 患者认知能力下降有较                      基因              引物序列（5′→3′）            产物长度/bp
        强的相关性。Tau蛋白的正常生理功能是与微管蛋白结                           actin-1   上游引物：ACGACGAGTCCGGCCCATCC      103
                                                                      下游引物：GAAAGCTGGTGGTGACGATGGTT
                                 [6]
        合，以维持细胞骨架的稳定性 。糖原合成激酶3β（gly-
                                                            Gsk-3     上游引物：TGCACGTCTTCCATCTGGTA      91
        cogen synthase kinase 3β，GSK-3β）是磷脂酰肌醇3-激酶                    下游引物：CACATCACCGCTTGTCGTTG
       （phosphoinositide3-kinase，PI3K）和蛋白激酶 B（protein       Age-1     上游引物：ATGGTTTCTTCAATTGGCTGG     81
        kinase B，Akt）的下游底物，其活化后可导致 Tau 蛋白过                            下游引物：GAACGGACACCATCATAAGAC
                                                            Akt-1     上游引物：TTCGAGCAAAGCCTAAGGA       81
        度磷酸化，从而使Tau蛋白大量沉积并形成缠结，进而破                                    下游引物：ATAACATTGTCGCTGCATCC
        坏神经元的生理功能          [7－8] 。相关研究发现，激活 PI3K/           Clp-1     上游引物：TTAGAGATAAGGTCGGTGGC      119
                                   [9]
        Akt途径可改善神经元细胞凋亡 。                                             下游引物：ATTTCCACCACCGAAACCT
            秀丽隐杆线虫（以下简称“线虫”）因其生命周期短、                       1.3  动物
        神经系统结构简单、遗传信息清晰和易于获得大量个体                               线虫（品系包括 BR5270、BR5271）均购自美国线虫
                                                     [10]
        模型等优点，常被用于神经退行性疾病的相关研究 。                           中心（https：//cgc.umn.edu），大肠埃希菌 Escherichia coli
        BR5270 品系线虫体内可表达人源 Tau 蛋白，具有加速                     OP50尿嘧啶合成缺陷菌株由北京生命科学研究所董梦
        Tau 蛋白聚集的特点，使其从成年第 1 天起就出现明显                       秋教授课题组惠赠。
        的神经元功能障碍；BR5271品系线虫体内表现出抗Tau                       2 方法与结果
                                                     [11]
        蛋白聚集的特点，常作为 BR5270 品系线虫的对照 。                       2.1  线虫的培养及同期化处理
        另外，相关研究发现，线虫体内 PI3K 和 Akt 的同源基因                    2.1.1 NGM培养基的制备           称取氯化钠0.60 g、蛋白胨
        是 Age-1 和 Akt-1 [12－13] 。基于此，本研究以 BR5270 品系        0.50 g、琼脂粉 3.40 g，加入 5 mg/mL 胆固醇溶液 200 μL
        线虫为 AD 模型，研究沙利度胺改善线虫体内 Tau 蛋白                      和纯水 200 mL，经高压蒸汽灭菌（121 ℃，15 min）后，依
        毒性及提高线虫学习记忆能力的作用及机制，以期为沙                           次加入浓度均为 1 mol/L 的 MgSO4溶液和 CaCl2溶液各
        利度胺治疗AD提供实验依据。                                     200 μL、1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH＝6.0）5 mL，摇匀后
        1 材料                                               倒板，加入 100 μL 大肠埃希菌溶液（由于线虫以大肠埃
        1.1  主要仪器                                          希菌为食，故后续将其称为“食物”）涂布均匀，于 37 ℃
            本研究所用主要仪器有HVE-50型高压蒸汽灭菌锅                       培养箱中培养8～12 h，备用。
       （日本Hirayama公司），DL-CJ-2ND Ⅰ型洁净工作台（北                  2.1.2  线 虫 的 同 期 化 处 理      将 2 种 线 虫（BR5270、
        京东联哈尔仪器制造有限公司），LY03-200 型生化培养                      BR5271 品系）置于含有食物的 NGM 培养基上培养
        箱（上海龙跃仪器设备有限公司），Nano Drop One C                    （16 ℃条件下）。挑取处于产卵期的线虫于含有食物的
        2000型超微量紫外分光光度计、Fresco 21型低温离心机                    NGM 培养基上，培养 4 h 后，移除线虫，保留虫卵；继续
       （美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司），Quant Studio 7   孵育虫卵至产卵期，即得同期化的亲代线虫，再将亲代
        Flex 型逆转录聚合酶链式反应（PCR）仪（美国 Applied                  线虫继续培养至产卵期，保留虫卵，即得同时期的虫
                                                             [14]
        Biosystems公司），Gel Doc XR 型自动凝胶成像系统（美               卵 。
                                  +
        国Bio Rad公司）。                                       2.2 沙利度胺对BR5270品系线虫的毒性预实验
        1.2  主要药品与试剂                                           取 BR5270 品系线虫，按“2.1.2”项下方法进行同期
            本研究所用主要药品与试剂有沙利度胺片（常州制                         化处理后，分为溶剂对照组（1％DMSO）和沙利度胺不
        药厂有限公司，批号 19031332，规格 50 mg/片），二甲基                 同质量浓度组（10、25、50、100 mg/mL），每组20条，并设


        中国药房    2022年第33卷第11期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11  ·1325 ·
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