Page 54 - 《中国药房》2022年10期
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5.88 g）。                                            裂解液，于冰上裂解 2 min，以 10 000 r/min 离心 10 min，
        2.2 动物分组、给药与造模                                      取上清液，以二喹啉甲酸法测定总蛋白浓度。用10％分
            将小鼠随机分为 6 组，即正常组、模型组、阳性组和                       离胶分离蛋白并转移到聚偏氟乙烯膜上。用含5％脱脂
        TPE低、中、高剂量组，每组10只。阳性组小鼠灌胃盐酸                         奶粉的 TBST 溶液封闭 2 h，加入含相应一抗的稀释液

        多奈哌齐4 mg/kg（以水为溶剂，剂量参考文献[9－10]设                    （稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；次日，室温孵育
        置），TPE各剂量组小鼠分别灌胃相应药液150、300、600                     1 h 后，用 TBST 溶液洗膜 3 次，再加入辣根过氧化物酶
        mg/kg（以水为溶剂，剂量参照《中华本草（第9册）》中黄                       标记的 IgG 二抗（稀释比例为 1 ∶ 10 000），室温孵育 2 h
                               [6]
        水枝的临床平均给药剂量 ，按人与小鼠的体表面积换                            后，用 TBST 溶液洗膜 3 次，以化学发光法显色，并置于
        算而得），正常组与模型组小鼠灌胃等体积水。每天早                            凝胶图像分析系统下成像。使用Image J 1.8.0软件分析
        上给药1次，连续22 d。于给药后第17～22天进行Mor-                      蛋白灰度值，以 GAPDH 为内参计算目标蛋白的相对表
        ris水迷宫实验，并在水迷宫训练前30 min对给药组和模                       达量。
        型组小鼠腹腔注射氢溴酸东莨菪碱 3 mg/kg（以生理盐                        2.7 统计学分析
                                         [11]
        水为溶剂）以建立学习记忆障碍模型 ；正常组小鼠腹                                采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。数据
        腔注射等体积生理盐水。                                         以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
        2.3 Morris水迷宫实验                                     两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
            于给药后第17天，各组小鼠腹腔注射东莨菪碱或生                         3 结果
        理盐水，然后参考文献[11]方法进行 Morris 水迷宫实                      3.1  TPE对小鼠学习记忆能力的影响
        验。迷宫中水温为（25±2）℃，水面高出平台 1 cm，平                       3.1.1  定位航行实验       随着训练天数的延长，各组小鼠
        台置于第Ⅱ象限中心位置，以Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ任一象限为入水                           的逃避潜伏期均呈缩短趋势。训练第1天，各组小鼠的
        点将小鼠放入水池。对各组小鼠进行为期5 d的定位航                           逃避潜伏期比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；训练
        行实验，每天 2 次，训练 60 s。若小鼠在 60 s 内找到平                   第2～5天，模型组小鼠的逃避潜伏期均较正常组显著延
        台，使其在平台停留10 s，记录其找到平台所用时间，作                         长（P＜0.05），提示东莨菪碱致小鼠学习记忆障碍模型

        为逃避潜伏期；若小鼠 60 s 内未找到平台，将其引导至                        建立成功；训练第3～5天，阳性组和TPE低（训练第3天
        平台并停留 10 s，将其逃避潜伏期记为 60 s。于给药后                      除外）、中（训练第3天除外）、高剂量组小鼠的逃避潜伏
        第22天进行空间搜索实验。撤掉平台，水池环境保持不                           期均较模型组显著缩短（P＜0.05）。结果见表1。
        变，小鼠从第Ⅳ象限入水，持续60 s，记录各组小鼠穿过                           表1   各组小鼠逃避潜伏期测定结果（x±±s，n＝10）
        平台次数、目标象限运动距离百分比。                                    组别       第1天     第2天     第3天     第4天     第5天
                                                             正常组     51.86±15.14  41.52±16.40  37.50±15.50  43.23±14.75  32.38±14.83
        2.4  脑组织形态观察
                                                             模型组     56.50±4.61  53.09±11.18 a  50.68±13.86 a  53.13±13.13 a  50.91±13.54 a
            Morris水迷宫实验结束后，将各组小鼠颈椎脱位处                        阳性组     52.10±11.45  40.31±16.23 b  33.37±14.76 b  38.88±16.05 b  25.06±15.46 b
        死。取小鼠脑组织以生理盐水洗净，每组随机取4只小                             TPE高剂量组 49.10±14.93  49.27±15.92  40.12±16.53 b  31.53±14.07 b  26.88±12.11 b
                                                             TPE中剂量组 49.91±14.31  54.19±13.11  58.40±4.11  40.89±14.73 b  35.75±16.58 b
        鼠右半脑组织于 4％多聚甲醛溶液中固定保存，剩余脑                            TPE低剂量组 53.82±12.15  48.31±15.01  53.80±9.07  26.91±13.06 b  40.27±18.31 b
        组织和其余小鼠脑组织均置于－20 ℃冰箱中保存。取                              a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
        固定于4％多聚甲醛溶液中的右半脑组织，石蜡包埋，切                           3.1.2  空间搜索实验       与正常组比较，模型组小鼠的穿
        片，经苏木精-伊红染色后，置于显微镜下观察各组小鼠                           过平台次数和目标象限运动距离百分比均显著降低
        海马组织细胞形态变化。                                        （P＜0.05）。与模型组比较，阳性组和TPE中、高剂量组
        2.5 脑组织相关指标测定                                       小鼠的穿过平台次数和目标象限运动距离百分比均显

            取各组小鼠冻存的脑组织，加入 9 倍体积的预冷生                        著升高（P＜0.05）。结果见表2。
        理盐水制成匀浆，于 4 ℃下以 10 000 r/min 离心 10 min，                 综合定位航行实验和空间搜索实验结果发现，中、
        取上清液。按照试剂盒说明书操作，测定各组小鼠脑组                            高剂量的 TPE 能够改善学习记忆障碍模型小鼠的学习
        织中AChE、ChAT、SOD、MDA、IL-6、TNF-α水平。                   记忆能力。
        2.6  海马组织中p-Tau、BACE1、APP蛋白表达测定                     3.2 TPE对小鼠脑组织形态的影响
            采用 Western blot 法进行测定。每组随机取 4 只小                    正常组小鼠的海马CA1区神经元排列紧密，形态完
        鼠冻存的海马组织，处理为细小组织后，加入适量组织                            整，细胞膜与细胞核清晰。与正常组比较，模型组小鼠


        ·1200 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 10                                 中国药房    2022年第33卷第10期
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