Page 39 - 《中国药房》2022年10期
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扎），每组 8 只。给药前，取各药物适量，充分溶解于水                        冲液，于4 ℃下匀浆后再以12 000 r/min离心5 min，取上
        中，配制成质量浓度分别为 0.176 g/mL（参附益心颗粒                     清液作为样品，备用。按试剂盒说明书步骤在每个标准
        低剂量组）、0.88 g/mL（参附益心颗粒高剂量组）、0.4                    品孔内加入标准液 20 μL，在每个样品测试孔内加入上
        mg/mL（福辛普利钠片组）的混悬液。假手术组和模型                         述样品 20 μL，室温孵育 15 min 后，使用荧光酶标仪于
        组灌胃水（1 mL/100 g），各药物组灌胃相应混悬液（1                     515 nm 波长处测定各孔的光密度（optical density，OD）
        mL/100 g），每天1次，连续4周。其中，参附益心颗粒高                     值，根据标准曲线计算各组样品的T-AOC水平。
        剂量相当于人每1 kg体质量临床用药剂量的5倍；参照                         2.4.3 NADPH 氧化酶活性         按 NADPH 检测试剂盒说
       《动物实验方法学》，大鼠的等效剂量相当于人的 6.3                          明书方法配制标准溶液和反应混合物。药物干预4周后，
        倍。成人（体质量60 kg）福辛普利钠片临床用药剂量为                        取各组大鼠心肌缺血区域组织（假手术组取与模型组缺
        每天40 mg，换算成大鼠等效剂量约为4 mg/kg。                        血区域相同部位组织）适量，每 20 mg 组织加入 400 μL
        2.2 血流动力学指标的检测                                     NADPH提取液，冰上匀浆后，于4 ℃下以12 000 r/min离
            药物干预 4 周后，称定各组大鼠体质量，腹腔注射                       心5 min，取上清液作为待测样品，备用。设置空白对照
        2％戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，并仰卧固定于试验台                      孔（NADPH 提取液）、标准溶液孔（标准溶液）和待测样
        上。经大鼠右侧颈动脉插入导管，连接生理记录仪，记                           品孔（待测样品），各孔加入相应液体 50 μL 后，再加入
        录大鼠的各项指标，包括左心室收缩末期压力（left                          NADPH反应混合物100 μL，室温避光反应20 min后，使
        ventricular end systolic pressure，LVESP）、左心室舒张末    用荧光酶标仪于460 nm波长处测定各孔的OD值，根据
        期压力（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、  标准曲线计算各组样品的NADPH氧化酶活性。
        左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax ）、左心室内压最大                    2.5 线粒体膜电位的检测
        下降速率（－dp/dtmax ）。                                      按照 JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒说明书提取样
        2.3  缺血心肌组织病理学观察                                   品，配制 JC-1 工作液。药物干预 4 周后，取各组大鼠心
            取“2.2”项下麻醉后的大鼠，于腹主动脉采血，采尽                      肌缺血区域组织（假手术组取与模型组缺血区域相同部
        血液后，开胸取出大鼠心脏，用磷酸盐缓冲液（pH7.4，下                       位组织）50 mg，剪碎后分别置于线粒体提取专用研磨器
        同）冲洗干净并立即置于 4％多聚甲醛组织固定液中固                          中，并采用荧光酶标仪（单体：激发光 490 nm，发射光
        定48 h。随后，取出心肌组织标本，脱水，常规石蜡包埋，                       530 nm；聚合物：激发光 525 nm，发射光 590 nm）检测大
        切片（厚度4 μm），经HE染色后，置于激光共聚焦显微镜                       鼠线粒体膜电位（以OD值表示）。
        下观察各组大鼠心肌组织病理损伤情况。                                 2.6  缺血心肌组织中 PINK1、Parkin、P62 蛋白表达的
        2.4  缺血心肌细胞氧化应激水平的检测                               检测
        2.4.1 ROS 水平    按 ROS 检测试剂盒说明书检测各组                     采 用 Western blot 法 检 测 各 组 大 鼠 心 肌 组 织 中
        大鼠心肌细胞内ROS水平。药物干预4周后，取各组大                          PINK1、Parkin、P62蛋白的表达水平。药物干预4周后，取
        鼠心肌缺血区域组织（假手术组取与模型组缺血区域相                           各组大鼠心肌缺血区域组织（假手术组取与模型组缺血
        同部位组织）适量，剪碎，加入适量的胰酶消化液，于                           区域相同部位组织）适量，剪碎后于 4 ℃下匀浆，再以
        37 ℃下混合裂解并过滤后，以1 200 r/min离心10 min，弃               12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，提取心肌组织总蛋
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        去上清液，沉淀用无血清培养液制成1×10 个/mL单细胞                       白。采用 BCA 法测定蛋白浓度后加入上样缓冲液，于
        悬液。按照体积比 1 ∶ 1 000[2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐                 沸水中变性 15 min 后，置于－20 ℃冰箱中保存，备用。
       （2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）∶ 无  取各组大鼠蛋白经凝胶电泳分离后，转至硝酸纤维素膜
        血清培养液]用无血清培养液稀释DCFH-DA探针，将单                        上，以 5％脱脂牛奶在室温下封闭 1 h；倒掉 5％脱脂牛
        细胞悬液加至稀释好的 DCFH-DA 探针溶液（终浓度为                       奶，用 TBST 缓冲液洗膜 5 min×3 次，加入相应一抗
        10 µmol/L）中，于 37 ℃培养箱内孵育 20 min 后，使用荧              （PINK1、Parkin、P62一抗的稀释比例为1 ∶ 500，β-actin一
        光酶标仪于 525 nm 波长处测定细胞内的荧光值（fluo-                    抗的稀释比例为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；加入相应二
        rescence units，FU）。将各组检测完的细胞于4 ℃下裂解                抗（稀释比例为 1 ∶ 500），室温孵育 1 h，同法洗膜后使用
        后以 13 000 r/min 离心 15 min，收集上清液。用 BCA 法            灰度扫描仪进行扫描显影，采用 Image J 软件计算条带
        检测总蛋白含量，以 FU 与蛋白含量的比值作为 ROS 水                      灰度值，并以目标蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰度值比
        平的定量依据。                                            值作为目标蛋白的表达水平。
        2.4.2 T-AOC 水平    按 T-AOC 检测试剂盒说明书方法               2.7 统计学方法
        配制标准液及染色工作液。药物干预4周后，取各组大                               使用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资
        鼠心肌缺血区域组织（假手术组取与模型组缺血区域相                           料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
        同部位组织）适量，每 20 mg 组织加入 100 μL 磷酸盐缓                  两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。


        中国药房    2022年第33卷第10期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 10  ·1185 ·
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