Page 93 - 《中国药房》2022年7期
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2.1.3 UPLC-MS检测 采用Dionex TM UltiMate TM U3000 前3行为对照组，加入100 μL含10％胎牛血清的DMEM
UPLC 仪进行色谱分离，使用反相色谱样本进行分析。 培养基。实验除上述溶媒对照组、模型对照组、8-MOP
按“2.1.2”项下条件对祛白片乙酸乙酯部位化学成分进 给药组和祛白片乙酸乙酯部位给药组外，另设本底对照
行分析，采用 Progenesis QI 软件 依次进行原始数据导 组（不含细胞的本底，仅加入培养基）。每组设5个复孔，
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入、峰对齐、峰提取、归一化处理，最后通过保留时间、质 加入相应培养基或试剂或药物至培养板中，每孔200 μL。
荷比、峰强度等信息在正、负离子模式下全扫描检测，分 各组细胞继续培养24、48 h，吸去上清液，更换为含CCK-8
别确定祛白片乙酸乙酯部位的化合物结构及相对百分 （CCK-8试剂与DMEM培养基体积比为1∶10）的溶液，放
含量。 入培养箱中培养4 h。用酶标仪在450 nm波长处测定各
2.2 脱黑色素细胞模型的初步药效学研究 孔光密度（OD）值，取平均值即为各组OD值。细胞增殖
2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取 0.1 g 祛白片乙酸 率（％）＝[（OD 各给药组－OD 本底对照组）/（OD 模型对照组或溶媒对照组－
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乙酯部位干浸膏，加入不含血清的 DMEM 培养基溶解 OD 本底对照组 ）]×100％ ，其中祛白片乙酸乙酯部位给药组
至10 mL，0.22 μm滤膜过滤后得祛白片乙酸乙酯部位母 细胞增殖率取模型对照组OD值计算，8-MOP 给药组细
液，后稀释成所需浓度作为供试品溶液。 胞增殖率取溶媒对照组OD值计算。
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2.2.2 脱黑色素细胞模型的建立 制备 B16 黑色素瘤 2.2.5 黑色素形成的检测 采用裂解法 检测促黑色
细胞悬液，用血球计数板进行计数。加入含10％胎牛血 素生成率，研究祛白片乙酸乙酯部位对黑色素形成的影
清、DMEM 培养基、1％青霉素-链霉素的培养液稀释细 响。接种、分组、给药方法同“2.2.3”项下，各组细胞继续
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胞，将细胞接种于96孔板，每孔含10 个细胞，5个复孔； 培养48 h，吸去上清液，PBS清洗2次后，采用12通道排
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长满后，再将细胞接种于 24 孔板，每孔含 10 个细胞，5 枪每孔加入 200 μL NaOH 溶液（1 mol/L），恒温水浴保
个复孔。将 B16 黑色素瘤细胞于 37 ℃、5％CO2培养箱 温（80 ℃）2 h 后，待充分裂解细胞和溶解黑色素颗粒，
中培养24 h，更换为含0.1 mmol/L H2O2的培养液与细胞 用酶标仪在490 nm波长处测定各孔OD值，取平均值即
共同孵育 4 h 后 ，弃掉培养液，得脱黑色素细胞。用 为各组 OD 值。促黑色素生成率（％）＝[（OD 各 给 药 组－
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DMEM培养基清洗细胞1次，更换含不同药物的培养液。 OD 模型对照组或溶媒对照组）/OD 模型对照组或溶媒对照组]×100％，其中祛白
2.2.3 显微镜下小鼠脱黑色素细胞变化的观察 用倒 片乙酸乙酯部位给药组促黑色素生成率取模型对照组
置生物显微镜观察脱黑色素细胞变化情况，研究祛白片 OD 值计算，8-MOP 给药组促黑色素生成率取溶媒对照
乙酸乙酯部位对其数量的影响。实验设溶媒对照组、模 组OD值计算。
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型对照组、8-MOP 给药组（10、50、100、150、200 μmol/L） 2.2.6 酪氨酸酶活性的检测 采用酶标法 检测酪氨
和祛白片乙酸乙酯部位给药组（10、50、100、150、200 酸酶活性，研究祛白片乙酸乙酯部位对黑色素形成过程
μg/mL） 。由于8-MOP母液溶剂为DMSO，因此实验设 中限速酶酪氨酸酶活性的影响。接种、分组、给药同
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溶媒对照组（DMSO原液稀释1 000倍）。模型对照组为 “2.2.3”项下，加入相应药物处理 24、48 h，弃去上清液，
脱黑色素细胞造模后加入相同体积的 DMEM 培养基。 PBS 洗涤 2 次，每孔加入 1％ TritonX-100 溶液 90 μL，于
溶媒对照组和模型对照组其余操作与各给药组平行。 －80 ℃放置 30 min，随后室温融化使细胞完全破裂，
分别精密称取 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g 祛白片乙酸乙酯部 37 ℃预温后加入 10 g/L L-DOPA 溶液（每孔 100 μL），
位干浸膏，加入不含血清的 DMEM 培养基溶解至 10 37 ℃孵育 30 min，用酶标仪在 490 nm 波长处测定 OD
mL，0.22 μm 滤膜过滤，作为祛白片乙酸乙酯部位给药 值，取平均值即为各组 OD 值。酪氨酸酶活性促进率
组给药溶液。各组细胞于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养 （％）＝[（OD 各给药组－OD 模型对照组或溶媒对照组 ）/OD 模型对照组或溶媒对照组]×
24、48 h 后，分别观察乙酸乙酯部位和 8-MOP 作用后脱 100％，其中祛白片乙酸乙酯部位给药组酪氨酸酶活性
黑色素细胞的变化。 促进率取模型对照组OD值计算，8-MOP 给药组酪氨酸
2.2.4 小鼠脱黑色素细胞增殖的检测 采用 CCK-8 比 酶活性促进率取溶媒对照组OD值计算。
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色法 检测脱黑色素细胞活性，研究祛白片乙酸乙酯部 2.3 统计学分析
位对其增殖的影响。取对数生长期B16黑色素瘤细胞， 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
胰酶消化后制成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔含10 4 料满足正态分布以x±s表示，多组间比较采用单因素方
个细胞。细胞于37 ℃、5％CO2培养箱中培养24 h，根据 差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝
“2.2.2”项方法下建立脱黑色素细胞模型。每张孔板的 0.05。
中国药房 2022年第33卷第7期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 7 ·855 ·
