Page 40 - 《中国药房》2022年7期
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度为 230 ℃，四极杆温度为 150 ℃，质量扫描范围为                       置]，每组设置 3 个复孔；并设置空白孔进行调零。将细
        30～600 amu。                                         胞常规培养至60％贴壁后，加入相应药液或空白培养基
        2.2.3  成分分析      利用 Analyst TF 1.6、PeakView1.2 数    干预 24 h，然后每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，孵育 1.5 h。
        据处理系统获取 UHPLC-QTOF-MS/MS 分析化合物的                     使用酶标仪在 450 nm 波长处检测各孔的光密度（OD），
        保留时间、质谱碎片信息等内容，通过与质谱数据库匹                            计算细胞的存活率＝（给药孔 OD－空白孔 OD）/（空白
        配以及与相关文献报道、对照品比对进行化合物鉴定。                            对照孔 OD－空白孔 OD）×100％；并使用显微镜观察各
        利用 MSD ChemStation F.01.00.1903 软件获取 GC-MS/         组细胞的形态进行综合分析。实验重复3次。
        MS分析化合物的信息，并与NIST17数据库进行信息匹                         2.3.4  细胞上清液中炎症因子 TNF-α、IL-6 含量的测定
        配，匹配度不低于90％ 。                                         采用ELISA法进行测定。取对数生长期的BV2细胞，
                            [15]
        2.3 羊栖菜提取物的体外抗炎作用考察                                 均匀接种在 96 孔板中（6×10 个/孔），分为空白对照组、
                                                                                    3
        2.3.1  提取物的制备        将羊栖菜干燥藻体剪碎后置于                  阳性药物组（1 μg/mL 脂多糖+5 μmol/L 帕罗西汀）和不
        10 000 mL 圆底烧瓶中，加入 80％乙醇[料液比为 1 ∶ 10                同质量浓度羊栖菜提取物组[1 μg/mL脂多糖+20（或40、
        （g/mL）]回流提取8 h，使用双层纱布过滤，收集滤液；残                      80）μg/mL 羊栖菜提取物]，每组设置 3 个复孔。待细胞
        渣加5倍量（mL/g）80％乙醇回流提取1 h，使用双层纱布                      培养至 60％贴壁左右时，加入药物干预 24 h，然后取细
        过滤；混合2次所得提取液，旋蒸挥去乙醇，将剩余浓缩                           胞上清液，按照试剂盒说明书操作，检测细胞上清液中
        液冷冻干燥 24 h，研磨后制成冻干粉，置于干燥器内避                         炎症因子TNF-α、IL-6的含量。实验重复3次。
        光保存。给药时取该提取物冻干粉用PBS溶解，然后过                           2.4 统计学方法
        0.2 μm除菌滤膜。                                             使用 Graphpad Prism 8.0.2 软件对数据进行统计分
        2.3.2 BV2 细胞的培养        将 BV2 细胞接种于含有 10％            析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差
        胎牛血清、1％双抗（100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉                 分析；方差齐时组间两两比较用Tukey法，方差不齐时组
        素）的高糖DMEM完全培养基中，将细胞置于37 ℃、5％                        间两两比较用Dunnett’s T3法。检验水准α＝0.05。
        CO2培养箱中常规培养、传代。本研究使用第 6 代细胞                         3 结果
        进行实验。                                               3.1  UHPLC-QTOF-MS/MS分析结果
        2.3.3 BV2 细胞活性测定         采用 CCK-8 法测定细胞存                经 UHPLC-QTOF-MS/MS 分析，从羊栖菜中共鉴定
        活率。取对数生长期的 BV2 细胞，均匀接种在 96 孔板                       出103种非挥发性成分，包括有机酸类成分3种、生物碱
                3
        中（6×10 个/孔），分为空白对照组、模型组（1 μg/mL脂多                   类成分13种、萜类成分24种、黄酮类成分13种、醌类成
        糖）、阳性药物组（1 μg/mL 脂多糖+5 μmol/L 帕罗西汀，                 分1种、糖苷类成分2种、维生素类成分5种、苯丙素类成
        浓度根据前期预实验结果设置）、不同质量浓度羊栖菜                            分5种、香豆素类成分7种、木脂素类成分2种、氨基酸类
        提取物组[1 μg/mL脂多糖+20（或40、60、80、100）μg/mL              成分8种、脂肪酸类成分1种，皂苷类成分3种、甾体类成
        海藻羊栖菜提取物，浓度梯度均根据前期预实验结果设                            分4种和其他类成分12种。结果见图1、表1。

          100                                                100
           90                                                90
           80                                                80
          相对强度/％  60                                        相对强度/％  60
           70
                                                             70
           50
                                                             50
                                                             40
           40
           30
           20                                                30
                                                             20
           10                                                10
           0                                                  0
             1  4  7  10 13 16 19  22 25 28  31 34 37 40 43 46 49  1  4  7  10 13 16 19  22 25 28  31 34 37 40 43 46 49
                                时间/min                                             时间/min
                             A.正离子扫描模式                                          B.负离子扫描模式
                                     图1 正、负离子扫描模式下羊栖菜的总离子流图
                            表1   羊栖菜中非挥发性成分的UHPLC-QTOF-MS/MS分析鉴定结果
                                保留时     加合   实测分  误差/                                                   化合物
         编号 化合物        分子式                             碎片离子m/z
                                间/min   模式   子量    ppm                                                  类型
         1  亚油酸        C18H32O2  31.80  －H  279.233 0  2.5 261.224 6                                    有机酸
         2  菊苣酸        C22H18O12  10.42  －H  473.072 6 －2.1 401.088 6，313.069 7，269.093 3               有机酸
         3  胆酸         C24H40O5  14.21  －H  407.280 3 －3.7 343.251 5                                    有机酸
         4  毕扣扣灵碱      C20H17NO6  7.32   +H  368.112 9  0.1 319.059 9，307.059 9，289.045 5，277.040 5，249.055 3，221.060 3，190.085 7，165.071 4  生物碱
         5  甜菜碱 [16]   C5H11NO2  12.68   +H  118.086 3  2.8 59.077 0，58.069 3                           生物碱
         6  腺苷         C10H13N5O4  1.87  +H  268.104 0 －0.8 136.062 4，119.035 0，57.047 6                生物碱
         7  腺嘌呤        C5H5N5    1.67    +H  136.061 8  0.6 119.035 7，92.026 1，65.015 7                 生物碱


        ·802 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 7                                    中国药房    2022年第33卷第7期
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