Page 39 - 《中国药房》2021年24期
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旋肱骨并将冈上肌肌腹提起，显露肩胛下肌肌腱，进行                           影液，置于凝胶成像仪中成像。采用Image J v1.8.0软件
        离断；缝合伤口，用无菌纱布覆盖，绷带固定。空白对照                          进行分析，以 PI3K、Akt、mTOR 蛋白与内参 GAPDH 的
        组兔同法操作，但不进行离断。各组兔缝合伤口后，于                           灰度值比值，Beclin1、LC3Ⅱ蛋白与内参β-actin的灰度值
                                                     [9]
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        后肢肌内注射青霉素（4×10 u）以预防感染，连续 3 d 。                    比值表示相应蛋白的表达水平。
        每组各取1只兔进行腱骨界面组织的病理形态学观察，                           2.8 统计学方法
        当该组织出现凹凸不平、内膜肿胀时，则表明造模成                                采用SPSS 23.0软件进行统计分析。符合正态分布
        功。造模成功后，空白对照组和模型组兔均灌胃生理盐                           的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分
        水；桃红四物汤各剂量组兔均灌胃相应药液；桃红四物                           析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        汤+LY294002组兔先灌胃桃红四物汤药液，再耳缘注射                       3 结果
        LY294002，均每天1次，连续12周。
                                                           3.1  桃红四物汤对肩袖损伤模型兔腱骨界面组织形态
        2.3 样品采集
                                                           的影响
            末次灌胃（注射）24 h 后，对各组兔进行心脏取血。
                                                               空白对照组兔腱骨界面组织光滑平整，内膜排列整
        血样静置1 h后，以3 000 r/min离心10 min，取上层血清                齐。模型组兔腱骨界面组织凹凸不平，内膜肿胀。桃红
        保存，备用。取血完成后，剖取兔腱骨界面组织，经 pH
                                                           四物汤低、中剂量组兔腱骨界面组织仍存在一定的内膜
        7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗后，部分以 2.5％戊二醛                    破损，但高剂量组兔腱骨界面组织光滑平整，内膜无明
        溶液固定，备用；部分于－80℃条件下保存，备用。                           显撕裂。桃红四物汤+LY294002 组兔腱骨界面组织肿
        2.4 兔腱骨界面组织的病理形态学观察
                                                           胀膨大，内膜撕裂明显，损伤情况类似模型组。结果见
            取“2.3”项下固定于2.5％戊二醛溶液中的各组兔腱
                                                           图1。
        骨界面组织适量，以PBS清洗5 min×3次，然后依次置于
        70％、80％、90％、100％乙醇中脱水，每次 10 min；将脱
        水后的组织进行干燥处理后，置于真空镀膜仪中镀膜，
        采用透射电子显微镜观察兔腱骨界面组织形态。
        2.5  兔血清中TNF-α、IL-10、IL-6水平的检测
            采用 ELISA 法进行检测。取“2.3”项下各组兔血清
        样品，根据相应试剂盒说明书方法操作，采用酶标仪于
        510 nm波长下检测兔血清中TNF-α、IL-10、IL-6的水平。
        2.6  兔腱骨界面组织中PI3K、Akt、mTOR mRNA表达
        水平的检测                                                      A.空白对照组                  B.模型组
            采用 q-PCR 法进行检测。取“2.3”项下冻存的各组
        兔腱骨界面组织适量（每组取 3 只），使用 Trizol 试剂进
        行裂解后，提取总 RNA，再逆转录为 cDNA，然后进行
        PCR 反应。PCR 反应体系为：cDNA 模板 2 μL，上、下游
        引物各 2 μL，SYBR 荧光染料 10 μL，无核酸酶水 4 μL。
        PCR 反应条件为：94 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，
        60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40次。以GAPDH
        作为内参，生成扩增曲线和溶解曲线，采用2                  －ΔΔCt 法计算
        PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达水平。                                C.桃红四物汤低剂量组             D.桃红四物汤中剂量组
        2.7  兔腱骨界面组织中 PI3K、Akt、mTOR、Beclin1、
        LC3ⅡⅡ蛋白表达水平的检测
            采用Western blot法进行检测。取“2.3”项下冻存的
        各组兔腱骨界面组织适量（每组取 3 只），经剪碎、RIPA
        裂解液裂解后，以 10 000 r/min 离心 10 min，取上清液，
        提取总蛋白并采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经变性
        后进行SDS-PAGE，转膜，以5％脱脂牛奶室温条件下封
        闭2 h；以TBST缓冲液洗膜5 min×3次，加入PI3K、Akt、
        mTOR、Beclin1、LC3Ⅱ、GAPDH、β-actin一抗（稀释度均                  E.桃红四物汤高剂量组            F.桃红四物汤+LY294002组
        为 1 ∶ 1 000），4℃条件下孵育过夜；以 TBST 缓冲液洗膜                       图1 各组兔腱骨界面组织形态的显微图
        5 min×3 次，加入二抗（稀释度为 1 ∶ 2 000），室温条件下               Fig 1 Morphological micrographs of tendon-bone in-
        孵育 1 h；以 TBST 缓冲液洗膜 5 min×3 次，滴加 ECL 显                    terface of rabbits in each group


        中国药房    2021年第32卷第24期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 24  ·2977 ·
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