Page 38 - 《中国药房》2021年24期
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repair the rotator cuff injury of rabbits，the mechanism of which may be associated with inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling
        pathway，activating autophagy and inhibiting inflammatory response.
        KEYWORDS Taohong siwu decoction；Rotator cuff injury；PI3K/Akt/mTOR signaling pathway；Autophagy；Rabbit

            肩袖损伤又称肩撞击综合征，是造成肩关节疼痛和                          均购自英国Abcam公司；山羊抗兔PI3K多克隆抗体、山
        肩关节活动受限的主要疾病，常表现为肌腱撕裂，并伴                            羊抗兔Akt多克隆抗体、山羊抗兔mTOR多克隆抗体、山
        有肌肉萎缩以及炎症细胞浸润等现象 。肌腱损伤以及                            羊抗兔 Beclin1 多克隆抗体、山羊抗兔 LC3Ⅱ单克隆抗
                                         [1]
        肌肉萎缩的本质是蛋白质过度降解，其中自噬-溶酶体                            体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G
        系统是重要的蛋白质水解途径，可在受损的肩袖中被激                           （IgG）二抗、山羊抗兔 GAPDH 单克隆抗体、山羊抗兔
        活，从而引起自噬反应的发生 。磷脂酰肌醇 3 激酶                           β-actin单克隆抗体、LY294002（纯度99.87％）、ECL显影
                                    [2]
        （PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白                      液、q-PCR 试剂盒（批号分别为 4678、4352、5421、6542、
                                        [3]
        （mTOR）是调控自噬的重要信号通路 。由此笔者推测，                         7895、4126、5367、5912、9901s、IPVH00012、IPVH05013）
        PI3K/Akt/mTOR通路可能是肩袖损伤修复的重要通路。                      均购自美国 Millipore 公司；BCA 蛋白测定试剂盒、十二
            中医认为，瘀血内阻、气虚血瘀而成痹，是导致肩袖                         烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒、
        损伤发生的重要原因，因此临床上常以活血化瘀疗法治                            脱脂奶粉、PVDF 膜（批号分别为 ST567、ST669、ST467、
                  [4]
        疗肩袖损伤 。桃红四物汤由桃仁、红花、生地、当归、赤                          ST562）均购自上海碧云天生物技术有限公司；PCR 引
        芍、川芎等6味药材组成，具有活血祛瘀、养血补血的功                           物由广州捷瑞生物科技有限公司设计合成（PCR引物序
        效 。临床研究表明，桃红四物汤能有效修复受损肩袖，                           列及产物长度信息见表1）；其余试剂均为实验室常用规
          [5]
                                     [6]
        减轻患者疼痛并改善肩关节功能 。但桃红四物汤修复                            格，水为纯净水。
        肩袖损伤的具体作用机制尚不明确。                                            表1 PCR引物序列及产物长度信息
            基于此，本研究首先构建兔肩袖损伤模型，然后检                             Tab 1  PCR primer sequence and product length
        测桃红四物汤对模型兔腱骨界面组织形态，血清中炎症                            基因              引物序列（5′→3′）             产物长度，bp
                                                            PI3K        上游：GGATGCTGAATGGTACTGGG       226
        相关因子[肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素 10
                                                                        下游：TGTAAGAGTGTAATCGCCGTG
        （IL-10）、IL-6]、PI3K/Akt/mTOR 信号通路相关蛋白和               Akt         上游：ATGAACGACGTAGCCATTGTG      116
        mRNA 以及自噬相关蛋白（Beclin1 和 LC3Ⅱ）表达的影                               下游：TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT
        响，并应用 PI3K 抑制剂 LY294002 验证桃红四物汤对                    mTOR        上游：TGTGGAAAAGTGCTCGGAAG       218
                                                                        下游：GGATGGTGCTCTCGTTGATG
        PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活作用，从而探讨该方对
                                                            GAPDH       上游：ATGATCGGTAGCTAGGCG         314
        肩袖损伤的修复作用及机制，以期为肩袖损伤的临床治                                        下游：TACGGTGGATGTAGGCAT
        疗提供参考。                                              1.3  动物
        1 材料                                                    本研究所用清洁级新西兰兔共 66 只，雄性，体质量
        1.1  主要仪器                                           约1.5 kg，由广东省医学实验中心提供，动物生产许可证
            本研究所使用的主要仪器包括Ⅸ81 型透射电子显                         号为SCXK（粤）2019-0035。
        微镜（德国 Leica 公司），JS-Power300 型电泳仪（上海培                2 方法
        清科技有限公司），AllegraX-15R型离心机、MK3型酶标                    2.1  桃红四物汤药液的制备
        仪（美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司），Centrifuge          取桃仁10 g、红花5 g、生地12 g、当归12 g、赤芍10 g、
        5424R 型 低 温 高 速 离 心 机（德 国 Eppendorf 公 司），           川芎10 g，加水200 mL煎煮45 min，过滤；取续滤液进行
        BioDoc-IT 型凝胶成像系统（美国 UVP 公司），ABI 7500               浓缩，制得质量浓度为 1 g/mL（以生药量计，下同）的
        型实时荧光定量聚合酶链式反应（q-PCR）仪（美国                           药液。
        Bio-Rad公司）等。                                        2.2 分组、造模与给药
        1.2 主要药品与试剂                                             将66只兔随机分为空白对照组、模型组和桃红四物
            桃仁、红花、生地、当归、赤芍、川芎药材均购自康美                        汤低、中、高剂量组（2.75、5.5、11 g/kg，剂量分别为临床
        药业有限公司（批号分别为 3567、3789、3899、3421、                   等 效 剂 量 的 1、2、4 倍）以 及 桃 红 四 物 汤 + LY294002
        3456、4421），经广州中医药大学第一附属医院四骨科陈                       组（5.5 g/kg 桃红四物汤+6.4 μg/kg LY294002，剂量参考
        建 发 教 授 鉴 定 为 真 品 。 青 霉 素 注 射 液（批 号                 文献[7]设置），每组11只。模型组和各药物组兔参考文
        2019103241315，规格 0.48 g）购自中诺药业（石家庄）有                献[8]方法行右侧肩胛下肌部分离断手术，以构建肩袖损
        限公司；戊巴比妥钠（批号20190112）购自天津市大茂化                       伤模型，具体方法如下：对兔腹腔注射3％戊巴比妥钠进
        学试剂厂；TNF-α、IL-10、IL-6酶联免疫吸附试验（ELISA）                行麻醉，再固定于动物手术台，经常规备皮、消毒后，对
        检测试剂盒（批号分别为ab224503、ab234503、ab224565）              兔右肩关节外侧的三角肌进行钝性分离，然后内收、外


        ·2976 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 24                                 中国药房    2021年第32卷第24期
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