Page 66 - 《中国药房》2021年23期
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于 PI3K/Akt/mTOR 信号通路探讨槲皮素对人宫颈鳞癌                     浓度顺铂组（顺铂终质量浓度分别为 0.625、1.25、2.5、5、
        顺铂耐药细胞 SiHa/DDP 的逆转作用，以期为宫颈癌的                       7.5 μg/mL，参考文献[6]设置），每组设5个复孔。对照组
        临床治疗提供新的思路。                                         加入完全培养基200 μL，不同浓度顺铂组加入含相应质
        1 材料                                                量浓度顺铂的完全培养基 100 μL，常规培养 24 h；弃去
        1.1 主要仪器                                            培养基，每孔加入CCK-8 试剂10 μL，于室温孵育2 h后，
            本研究所用 MR-96A 型自动酶标仪购自深圳迈瑞                       采用酶标仪于 450 nm 波长处检测各孔光密度（OD）
        生物医疗电子股份有限公司，CytoFLEX 型流式细胞仪                        值。计算细胞抑制率[细胞抑制率＝（对照组OD值－给
        购自美国Beckman Coulter公司，DGENETM型自动电泳                  药组OD值）/对照组OD值×100％]和顺铂的半抑制浓度
        凝胶成像分析仪购自日本 Olympus 公司，CCL-170B-8                  （IC50 ），再在此基础上计算 SiHa/DDP 细胞的耐药指数
        型细胞培养箱购自上海必宝生物科技有限公司。                              （耐药指数＝SiHa/DDP细胞的IC50/SiHa细胞的IC50]。
        1.2 主要药品与试剂                                         2.3 槲皮素对SiHa/DDP细胞的耐药逆转作用考察
            本研究所用DMEM 培养基、胎牛血清（批号分别为                        2.3.1  槲皮素对 SiHa 细胞、SiHa/DDP 细胞的抑制作用
        17M483、1967839）购自美国Gibco公司；青霉素-链霉素                  考察    采用 CCK-8 法进行考察。取对数生长期的 SiHa
                                                                                       5
                                                                                          －1
        溶液、CCK-8 试剂、AnnexinⅤ-FITC 细胞凋亡检测试剂                  细胞和SiHa/DDP细胞，按2×10 mL 接种于96孔板中，
        盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号分别为 1936917、                      每孔 100 μL，常规培养 12 h 后，将两种细胞均分别分为
        C0038、C1062L、P0012）均购自上海碧云天生物技术有                    对照组、不同浓度槲皮素组（槲皮素的终质量浓度分别
        限公司；顺铂（批号H37021358）购自山东齐鲁制药有限                       为 0.005、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 μg/mL，
        公司；槲皮素、兔抗小鼠Akt单克隆抗体、兔抗小鼠磷酸                          参考文献[6]设置），每组设5个复孔。对照组加入200 μL
        化 Akt（p-Akt）单克隆抗体、兔抗小鼠 mTOR 单克隆抗                    完全培养基，不同浓度槲皮素组加入含相应质量浓度槲
        体、兔抗小鼠磷酸化mTOR（p-mTOR）单克隆抗体（批号                       皮素的完全培养基100 μL，常规培养24 h；弃去培养基，
        分别为Q4951、SAB4500796、SAB4504331、SAB4501038、          每孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，于室温孵育 2 h 后，采用酶
        SAB4504476） 均 购 自 美 国 Sigma 公 司 ；兔 抗 小 鼠            标仪于 450 nm 波长处检测各孔 OD 值，按“2.2”项下方
        p70S6K单克隆抗体、兔抗小鼠P-pg单克隆抗体、兔抗小                       法计算槲皮素对SiHa、SiHa/DDP细胞的抑制率。
        鼠 GAPDH 单 克 隆 抗 体（批 号 分 别 为 14485-1-AP、             2.3.2 槲皮素对SiHa/DDP细胞的逆转耐药倍数检测 采
        2236-1-AP、16825-1-AP）均购自美国Proteintech公司；兔           用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期的 SiHa/DDP 细
                                                                         －1
        抗小鼠磷酸化 p70S6K（p-p70S6K）多克隆抗体（批号                     胞，按2×10 mL 接种于96孔板中，每孔100 μL，常规培
                                                                     5
        RS-2602R）购自美国 Cell Signaling 公司；辣根过氧化物              养 12 h 后，将细胞分为对照组、不同浓度顺铂组、顺铂+
        酶（HRP）标记的羊抗兔免疫球蛋白 G（二抗）（批号                          不同浓度槲皮素组，每组设5个复孔。对照组加入完全
        20000258）购自美国CST公司；高效ECL显色试剂（批号                     培养基200 μL，不同浓度顺铂组加入含顺铂的完全培养
        1515601）购 自 美 国 Millipore 公 司 ；雷 帕 霉 素（批 号          基 100 μL（顺铂终质量浓度分别为 0.625、1.25、2.5、5、
        H12J10J79598，纯度 99％）购自上海源叶生物科技有限                    7.5 μg/mL），顺铂+不同浓度槲皮素组加入含顺铂和槲皮
        公司；其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。                              素的完全培养基 100 μL（固定顺铂的终质量浓度为 2.5
        1.3  细胞                                             μg/mL，槲皮素的终质量浓度分别为 0.005、0.01、0.025、
            人宫颈鳞癌细胞SiHa 购自中国科学院上海生科院                        0.05、0.075、0.1、0.125、0.15 μg/mL，参考“2.2”项下结果
        细胞资源中心，人宫颈鳞癌顺铂耐药细胞 SiHa /DDP购                       以及预实验结果设置），常规培养 24 h；弃去培养基，每
        自湖南丰晖生物科技有限公司。                                      孔加入 CCK-8 试剂 10 μL，于室温孵育 2 h 后，采用酶标
        2 方法                                                仪于 450 nm 波长处检测各孔 OD 值，按“2.2”项下方法
        2.1 细胞培养                                            计算细胞抑制率和药物的 IC50，并计算槲皮素对 SiHa/
            将 SiHa 细胞和 SiHa/DDP 细胞以含有 10％胎牛血                DDP 细胞的逆转耐药倍数[逆转耐药倍数＝顺铂组的
        清、1％青霉素-链霉素的DMEM培养基（以下简称“完全                         IC50/（顺铂+不同浓度槲皮素组的IC50 ）]        [7－8] 。
        培养基”），于 37 ℃、5％CO2的培养箱中进行常规培养。                      2.4 槲皮素对SiHa/DDP细胞凋亡率的影响考察
                                                                                                    5
                                                                                                        －1
        在细胞状态良好、融合度达 80％～90％时，以磷酸盐缓                             取对数生长期的 SiHa/DDP 细胞，按 2×10 mL 接
        冲液（PBS）清洗后，进行传代。取对数生长期细胞进行                          种于96孔板中，每孔100 μL，常规培养12 h后，将细胞分
        后续实验。                                               为对照组、槲皮素组（0.005 μg/mL）、顺铂组（2.5 μg/mL）、
        2.2  SiHa/DDP细胞的耐药指数检测                              顺铂+槲皮素组（2.5 μg/mL 顺铂+0.005 μg/mL 槲皮素）、
            采用CCK-8法进行检测。取对数生长期的SiHa细                       槲皮素+通路抑制剂组（0.005 μg/mL 槲皮素+20 nmol/L
        胞和SiHa/DDP细胞，按2×10 mL 接种于96孔板中，每                    雷帕霉素），每组设5个复孔。各组给药浓度参考预实验
                                 5
                                     －1
        孔 100 μL，常规培养 12 h 后，将细胞分为对照组和不同                    结果设置。对照组加入完全培养基200 μL，各给药组加

        ·2876 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23                                 中国药房    2021年第32卷第23期
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