Page 67 - 《中国药房》2021年23期

入含相应药物的完全培养基 200 μL，常规培养 24 h；收 表1 各组SiHa细胞和SiHa/DDP细胞的抑制率测定结
集细胞，以 4 ℃的 PBS 洗涤 2 次，并调整细胞密度为 1× 果（x±±s，n＝5）
－1
5
10 mL ，以1 000 r/min 离心5 min；弃上清液，下层细胞 Tab 1 Inhibition rate of SiHa and SiHa/DDP cells in
加入Annexin Ⅴ-FITC结合液重悬；取细胞悬液100 μL， each group（x±±s，n＝5）
加入Annexin Ⅴ-FITC试剂5 μL以及碘化吡啶10 μL，于 组别 SiHa细胞 SiHa/DDP细胞
室温避光孵育 15 min 后，加入 PBS 至 500 μL，采用流式 对照组 0.73±0.37 0.84±0.39
槲皮素0.005 μg/mL组 6.08±2.26 8.70±1.65
细胞仪检测各组细胞凋亡率。
槲皮素0.01 μg/mL组 12.31±2.50 13.50±2.30
2.5 槲皮素对SiHa/DDP细胞中Akt、mTOR、p70S6K、 槲皮素0.025 μg/mL组 19.33±1.99 20.72±3.65
P-gp蛋白表达的影响考察 槲皮素0.05 μg/mL组 34.23±3.16 50.77±3.32 ＊＊
槲皮素0.075 μg/mL组 50.78±2.75 63.85±2.89 ＊＊
采用Western bolt法进行考察。取对数生长期的SiHa/
槲皮素0.1 μg/mL组 63.08±2.02 71.54±3.07 ＊
－1
DDP细胞，按2×10 mL 接种于96孔板中，每孔100 μL， 槲皮素0.125 μg/mL组 66.89±2.71 73.23±2.92 ＊
5
常规培养12 h后，按“2.4”项下方法分组、给药和培养，每 槲皮素0.15 μg/mL组 72.92±2.67 81.54±3.08 ＊
＊
＊＊
组设3个复孔。收集细胞，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 注：与同一剂量下的SiHa细胞比较，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
裂解液于冰上裂解 30 min，以 12 000 r/min 离心 10 min Note：vs. SiHa cells under same dosage，P＜0.05， P＜0.01
后收集总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白 3.3 槲皮素对SiHa/DDP细胞凋亡的影响
浓度。将蛋白煮沸 10 min 进行变性，然后取 50 μg 变性 与对照组比较，槲皮素组、顺铂组、顺铂+槲皮素组、
蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；转 槲皮素+通路抑制剂组的细胞凋亡率均显著升高（P＜
0.05）；与槲皮素组和顺铂组分别比较，顺铂+槲皮素组、
膜，以 5％脱脂奶粉封闭1 h，分别加入 Akt（稀释度为1 ∶
槲皮素+通路抑制剂组的细胞凋亡率均显著升高（P＜
1 000）、p-Akt（稀释度为 1 ∶ 1 000）、mTOR（稀释度为 1 ∶
1 000）、p-mTOR（稀释度为1 ∶ 1 000）、p-p70S6K（稀释度 0.05）。结果见图1、表2。
为 1 ∶ 1 000）、p70S6K（稀释度为 1 ∶ 2 000）、P-gp（稀释度 10 4 10 4
为 1 ∶ 1 000）、GAPDH（稀释度为 1 ∶ 2 000）一抗，于 4 ℃ 10 3 10 3
下孵育过夜；以PBST缓冲液洗涤10 min×3次，加入相应
二抗（稀释度为1 ∶ 1 000），于室温孵育 2 h；以PBST缓冲 Propidium iodide 10 2 Propidium iodide 10 2
液洗涤 10 min×3 次，加入 ECL显色试剂显色，置于凝胶 10 1 10 1
成像分析仪中成像。采用 Image J v1.7.0 软件分析，以
10 0 10 0
p-Akt 与 Akt、p-mTOR 与 mTOR、p-p70S6K 与 p70S6K 的 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
AnnexinⅤ-FITC AnnexinⅤ-FITC
灰度值比值分别表示Akt、mTOR、p70S6K的蛋白磷酸化 A.对照组 B.槲皮素组
水平，以P-gp与内参GAPDH的灰度值比值表示P-gp蛋 10 4 10 4
白的表达水平。 10 3 10 3
2.6 统计学方法
采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。数据以x±s Propidium iodide 10 2 Propidium iodide 10 2
表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较 10 1 10 1
采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
10 0 10 0
3 结果 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
AnnexinⅤ-FITC AnnexinⅤ-FITC
3.1 SiHa/DDP细胞的耐药指数 C.顺铂组 D.顺铂+槲皮素组
顺铂对 SiHa/DDP 细胞的 IC50为 14.81 μg/mL，显著 10 4
高于其对 SiHa 细胞的 IC50 （2.86 μg/mL，P＜0.01）；SiHa/ 10 3
DDP细胞的耐药指数为5.19。
3.2 槲皮素对SiHa/DDP细胞的耐药逆转作用 Propidium iodide 10 2
不同浓度的槲皮素对SiHa细胞和SiHa/DDP细胞均 10 1
具有抑制作用，且细胞抑制率随着槲皮素浓度的增加呈
10 0
逐渐升高的趋势。另外，与同一剂量作用于SiHa细胞比 10 0 10 1 10 2 10 3 10 4
AnnexinⅤ-FITC
较，槲皮素（0.005～0.025 μg/mL除外）对SiHa/DDP细胞 E.槲皮素+通路抑制剂组
的抑制作用显著增强（P＜0.05 或 P＜0.01），结果见表 图1 各组SiHa/DDP细胞凋亡的流式图
Fig 1 Flow cytometry chart of the apoptosis of SiHa/
1。另经计算，顺铂联合槲皮素对 SiHa/DDP 细胞的 IC50
为3.71 μg/mL，槲皮素的逆转耐药倍数为4.00。 DDP cells in each group

中国药房 2021年第32卷第23期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23 ·2877 ·