Page 56 - 《中国药房》2021年22期
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复制AS模型。术后10周，假手术组和模型组兔灌胃生                           移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以5％脱脂奶粉于室温下
        理盐水，各药物组灌胃相应药液（溶剂均为生理盐水），                           封闭 2 h 后，加入 TLR4、NF-κB p65、GAPDH 一抗（稀释
        给药体积均为100 mL，每天给药1次，连续12周，给药剂                       比例分别为1 ∶ 1 000、1 ∶ 200、1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；用
        量均依据本课题组预实验结果设置。                                    TBST缓冲液洗涤10 min×3次，加入HRP标记的山羊抗
        2.3 采样方法                                            小鼠 IgG 二抗（稀释比例为 1 ∶ 15 000），室温孵育 1 h；用
            末次给药后，用4％水合氯醛溶液麻醉各组兔，收集                         TBST缓冲液洗涤10 min×3次，加入ECL化学发光显色
        其腹主动脉血 40 mL 后，处死，分离腹主动脉。血样于                        液显影，于自动凝胶成像分析仪中成像。使用 Sensi
        室温下放置 30 min 后，以 5 000 r/min 离心 15 min，取上           Ansys 13.0 软件进行分析，以目标蛋白与内参蛋白
        层血清，备用。                                            （GAPDH）的灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。
        2.4 兔腹主动脉的病理观察                                      2.10  统计学方法
            取各组兔腹主动脉，以石蜡包埋后切片（厚度约5 μm），                         采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。数据均
        脱蜡至水并经水洗后，在异丙醇中放置5 min，用滤纸吸                         以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
        去异丙醇，加入0.5％油红O染色30 min；用水清洗3次，                      两比较采用 LSD 检验（方差齐）或 Dunnett’s 检验（方差
        加入苏木精染色5 min；用盐酸-乙醇溶液（1∶100，V/V）分                   不齐）。检验水准α＝0.05。
        色、氨水返蓝后，用中性树胶封片，使用光学显微镜观察                           3 结果
        其腹主动脉的病理变化（红褐色为血脂沉积）。                               3.1 兔腹主动脉的病理变化
        2.5 兔腹主动脉内壁的病理观察                                        假手术组兔的腹主动脉管腔内可见少许脂质，未见
            取各组兔腹主动脉，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）                    明显斑块和血管内皮损伤。与假手术组比较，模型组兔
        清洗表面后，快速放入2.5％戊二醛固定液中固定4 h；用                        的腹主动脉管腔内膜富含脂质，管壁厚度和斑块面积均
        PBS清洗5 min×4次，再放入1％锇酸固定液中固定1 h；                     明显增加，可见明显的血管内皮损伤。与模型组比较，
        用 PBS 清洗 5 min×4 次，依次放入 70％、80％、90％、                心脉康低剂量组兔的腹主动脉结构相对完整，管腔内膜
        100％乙醇中脱水10 min，彻底干燥后，使用扫描电子显                       脂质沉积较少；心脉康高剂量组和辛伐他汀组兔的腹主
        微镜观察其腹主动脉内壁的病理变化。                                   动脉结构正常，局部有小灶性钙化颗粒物沉积，病变轻
        2.6  兔血脂指标含量的检测                                     微，斑块小，弹力板基本完整。结果见图1。
            取各组兔腹主动脉血清样品适量，按照相应试剂盒                          3.2  兔腹主动脉内壁的病理变化
        说明书方法操作，使用全自动生化分析仪检测其血清中                                假手术组兔的腹主动脉内壁光滑，未见明显肿胀、
        TG、TC、LDL-C、HDL-C的含量。                               损伤、粥样硬化斑块和泡沫细胞。与假手术组比较，模
        2.7  兔血清中IL-1β、IL-6含量的检测                            型组兔的腹主动脉内壁可见许多粥样硬化斑块，在斑块
            采用 ELISA 法进行检测。取各组兔腹主动脉血清                       表面可见纤维帽和泡沫细胞，在硬化斑块上可见黏附的
        样品适量，按照相应试剂盒说明书方法操作，使用酶标                            巨噬细胞，血管内皮损伤明显。与模型组比较，心脉康
        仪检测其血清中IL-1β、IL-6的含量。                               低剂量组兔的腹主动脉内壁斑块面积缩小，血管内皮损
        2.8  兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κB p65含量的检测                    伤较轻；心脉康高剂量组和辛伐他汀组兔的腹主动脉内
            采用免疫组化法进行检测。取各组兔腹主动脉，以                          壁斑块明显较少，血管内皮相对完整，未见明显损伤。
        石蜡包埋后切片（厚度约5 μm），按照相应试剂盒说明书                         结果见图2。
        方法操作，使用全自动免疫组化染色机分别进行 TLR4                          3.3 兔血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量变化
        和NF-κB p65免疫组化染色，使用光学显微镜观察并采                            与假手术组比较，模型组兔血清中 TC、TG、LDL-C
        集放大时的显微图像，同时运用Image J v1.8.0 图像分析                   含量均显著升高（P＜0.01），HDL-C 含量显著降低（P＜
        软件计算兔腹主动脉组织中TLR4、NF-κB p65在465 nm                   0.05）。与模型组比较，心脉康高剂量组和辛伐他汀组兔
        波长下的积分光密度（IOD），并以此表示两者含量。                           血清中TC、TG、LDL-C含量均显著降低（P＜0.05或P＜
        2.9  兔腹主动脉组织中 TLR4、NF-κB p65 蛋白表达水                  0.01），各药物组HDL-C含量和心脉康低剂量组TC、TG、
        平的检测                                                LDL-C 含量差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见
            采用 Western blot 法进行检测。取各组兔腹主动                   表1。
        脉，经裂解、匀浆、静置后，以 12 000 r/min 离心 10 min，              3.4 兔血清中IL-6、IL-1β的含量变化
        获取蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度后，煮沸5 min使                             与假手术组比较，模型组兔血清中 IL-6、IL-1β含量
        蛋白变性。取变性后的蛋白样品经SDS-PAGE分离，转                         均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，心脉康高剂量


        ·2738 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 22                                 中国药房    2021年第32卷第22期
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