Page 27 - 《中国药房》2021年20期

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链霉素的DMEM/F12培养基重悬，以5×10 个/孔接种于 β激活激酶 1（p-TAK1）的表达水平。实验重复 3 次。
6孔板中，每组设6个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5％ 2.10 大鼠子宫平滑肌瘤细胞中 HMGB1、PI3K、p-Akt
CO2 细胞培养箱中培养，待细胞贴壁且生长至 70％～ 和NF-κB p65蛋白表达水平的检测
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80％时，收集细胞至15 mL离心管（≥1×10 个/管）中，以 采用 Western blot 法进行检测。将从各组大鼠体内
1 500 r/min 离心 5 min，收集细胞沉淀，用 1×D-Hanks 试 分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌瘤细胞以 1×
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液（pH 7.2）重悬和洗涤2次后，将1×10 个细胞重悬于1× 10 个/孔接种于6孔板中，每组设3个复孔。将各组细胞
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结合缓冲液中，加入Annexin Ⅴ-APC试剂10 μL，轻轻混 置于 37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培养 24 h 后，收集细
合，在室温（25 ℃）避光条件下孵育 15 min，使用流式细 胞，加入裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA蛋白定量法
胞仪检测细胞凋亡情况并计算凋亡率（以早期凋亡细胞 计算各组样品的总蛋白量，并将蛋白煮沸变性；取变性
计）。实验重复3次。 蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，
2.8 大 鼠 子 宫 平 滑 肌 细 胞/子 宫 平 滑 肌 瘤 细 胞 中 并用含 5％脱脂奶粉的 PBST 溶液室温封闭 2 h；加入
HMGB1 mRNA表达水平的检测 HMGB1、PI3K、p-Akt、NF-κB p65、β-actin（用于检测细胞
采用 RT-qPCR 法进行检测 。将从各组大鼠体内 质中蛋白表达的内参）和 lamin B1（用于检测细胞核中
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分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌细胞或子宫 蛋白表达的内参）一抗（稀释比例均为 1 ∶ 2 000），4 ℃下
平滑肌瘤细胞以1×10 个/孔接种于6孔板中，每组设3个 孵育过夜；用TBST溶液清洗3次后，加入HRP标记的免
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复孔。将各组细胞置于 37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培 疫球蛋白 G 二抗（稀释比例为 1 ∶ 5 000），室温孵育 1 h；
养 24 h 后，收集细胞至 1.5 mL 无 DNA/RNA 酶离心管 用 TBST 溶液清洗 3 次后，加入 ECL 发光液显影。利用
中，提取各组细胞的总 RNA，按照反转录试剂盒说明书 多功能成像仪成像并用 Image J v1.8.0 软件分析，计算
方法操作，将RNA反转录成cDNA。以上述cDNA为模 目标蛋白与内参蛋白的灰度值比值，再与模型组进行比
板，用焦碳酸二乙酯（DEPC）水稀释 10 倍后进行扩增。 较，用以表示目标蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
扩增体系（20 µL）包括 2×ChamQ Universal SYBR qPCR 2.11 统计学方法
Master Mix 10 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各 0.4 µL， 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资
cDNA模板5 µL，加水至10 µL。扩增条件如下：95 ℃预 料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 两两比较采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
共 40 个 循 环 。 HMGB1 的 上 游 引 物 序 列 为 5′-GAT- 3 结果
GACAAGCAGCCCTAT-3′，下游引物序列为 5′-TCCAT- 3.1 大鼠子宫形态与子宫系数变化
GCCAATTTACAAC-3′，产物片段大小为 481 bp；β-actin 正常对照组大鼠子宫肌层正常，子宫平滑肌细胞结
的 上 游 引 物 序 列 为 5′-TCAGGTCATCACTATCGGC- 构完整、分布均匀。与正常对照组比较，模型组大鼠子
AAT-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-AAAGAAAGGGTGTA- 宫肌层明显增厚，子宫平滑肌细胞明显增多且大小不
AAACGCA-3′，产物片段大小为432 bp。利用2 －ΔΔCt 法进 一，部分区域的肌纤维排列紊乱；消癥汤中、高剂量组和
行分析，将每组所测得的 HMGB1 cDNA 拷贝数分别与 化学药阳性对照组、中药阳性对照组大鼠子宫肌层未见
β-actin 相比，再将所得值与正常对照组相比，以两者相 明显增厚，子宫平滑肌细胞分布较均匀；消癥汤低剂量
对拷贝数比值表示 HMGB1 mRNA 的相对表达水平。 组大鼠子宫肌层有所增厚，但厚度低于模型组，子宫平
实验重复3次。 滑肌细胞数增加，但少于模型组。
2.9 大鼠子宫平滑肌瘤细胞中 p-Akt、NF-κB 抑制蛋 与正常对照组比较，模型组大鼠的子宫系数显著升
白α、磷酸化转化生长因子β激活激酶1表达水平的检测 高（P＜0.01）。与模型组比较，消癥汤各剂量组和各阳
利用 PathScan Antibody Array 试剂盒以酶联免疫 性对照组大鼠的子宫系数均显著降低（P＜0.01），且消
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吸附测定法进行检测。实验参考文献[28]进行操作：将 癥汤的作用有剂量依赖趋势。结果见表1。
从模型组和各给药组大鼠体内分离到的且处于对数生 表1 消癥汤对模型大鼠子宫系数的影响（x±±s，n＝15，
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长期的子宫平滑肌瘤细胞以 1×10 个/孔接种于 6 孔板 mg/g）
中，每组设3个复孔。将各组细胞置于37 ℃、5％CO2细 Tab 1 Effects of Xiaozheng decoction on uterine coef-
胞培养箱中培养 24 h 后，收集细胞，加入裂解液提取细 ficient of model rats（x±±s，n＝15，mg/g）
胞总蛋白，利用 BCA 蛋白定量法计算各组样品的总蛋 组别 子宫系数 组别 子宫系数
白量；将总蛋白置于玻片上，使用试剂盒内的生物素化 正常对照组 2.63±0.33 消癥汤高剂量组 2.90±0.44 ##
细胞应激与凋亡通路相关细胞因子抗体混合物进行孵 模型组 9.27±0.36 ＊＊ 化学药阳性对照组 2.77±0.35 ##
消癥汤低剂量组 6.90±0.38 ## 中药阳性对照组 2.79±0.37 ##
育，依次加入试剂盒中的Streptavidin-conjugated HRP 和
消癥汤中剂量组 4.92±0.37 ##
LumiGLO 化学发光液显影。利用多功能成像仪成像
®
注：与正常对照组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.01
＊＊
##
并 用 Image J v1.8.0 软 件 进 行 分 析 ，以 灰 度 值 表 示 Note：vs. normal control group， ＊ ＊ P＜0.01；vs. model group，
p-Akt、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）、磷酸化转化生长因子 ## P＜0.01
中国药房 2021年第32卷第20期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 20 ·2453 ·