Page 26 - 《中国药房》2021年20期
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（lamin B1）单克隆抗体、HRP 标记的免疫球蛋白 G 二抗                   取子宫，称定子宫质量后，分别以肉眼和显微镜观察子
        （批 号 分 别 为 ab18256、ab8226、ab140307、ab183894、        宫形态，并计算子宫系数：子宫系数（mg/g）＝子宫质量/
        ab16502、ab194109、ab6721）均购自英国 Abcam 公司；             体质量。
        RNA 提取试剂 SuperfecTRI total RNA isolation reagent    2.4 大鼠子宫平滑肌细胞/子宫平滑肌瘤细胞的培养
        （批号 3101-400）购自上海普飞生物技术有限公司；                            参照文献[25－26]方法制备、培养大鼠子宫平滑肌
        M-MLV反转录试剂盒（批号28025013）购自美国Promega                  细胞/子宫平滑肌瘤细胞：在无菌条件下，取正常对照组
        公司；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（批号          大鼠的子宫平滑肌组织或模型组、各给药组大鼠的子宫
        7E303A9）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；                          平滑肌瘤组织，利用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2，下
        HMGB1 和β-actin 引物委托生工生物工程（上海）股份有                    同）冲洗表面 3 次，取 1～2 cm 的组织置于无菌培养皿
                                                                                      3
        限公司设计、合成；PathScan Antibody Array试剂盒（批号              中，剪碎成 1 mm 的小块，加入混合消化液（含 0.25％Ⅰ
                                                                          3
                               ®
        12856S）购自美国Cell Signaling Technology公司；其余试          型胶原酶和 0.25％胰酶）3 mL，在 37 ℃下消化 1 h，再加
        剂均为实验室常用规格或分析纯，水为超纯水。                               入含 20％胎牛血清的 DMEM/F12 培养基 2 mL 终止消
            半枝莲、白花蛇舌草、三棱、莪术、乳香、没药、橘核、                       化，过200目细胞筛，弃去组织块，以1 000 r/min离心10
        皂角刺、海藻、牡蛎、石见穿和荔枝核饮片均由青岛市中                           min，取上清液置于35 mm培养皿中，在37 ℃、5％CO2细
        医医院提供，经青岛市中医医院主任药师丁月方鉴定均                            胞培养箱中培养。收集第 1 代和第 2 代细胞，用台盼蓝
        为真品。                                                染色，检测细胞存活情况。
        1.3 实验动物                                            2.5 大鼠子宫平滑肌瘤细胞增殖率的检测
            本研究所用动物为 SPF 级 SD 大鼠，共 105 只，3 月                    采用MTT法进行检测。将从各组大鼠体内分离到
        龄，雌性，体质量为（285.0±16.5）g，由青岛医科大学附                     的且处于对数生长期的子宫平滑肌细胞或子宫平滑肌
        属医院实验动物中心提供，动物使用许可证号为SYXK                           瘤细胞以1×10 个/孔接种于96孔板中，每组设6个复孔，
                                                                        5
        （鲁）2019-0022。本实验方案通过动物伦理委员会批准                       其中 3 个孔直接加入 MTT 溶液 10 μL ，另外 3 个孔置于
        和审核，并严格按照青岛医科大学附属医院关于实验动                            37 ℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养48 h，于实验终止
        物使用和保护的相关规定进行操作。                                    前加入 MTT 溶液 10 μL 。加入 MTT 溶液后，各孔均继
        2 方法                                                续培养 4 h，再加入二甲基亚砜 150 μL 终止反应，振荡
        2.1  消癥汤的配制                                         10 min，利用酶标仪于490 nm波长处测定各孔的吸光度
            按消癥汤处方比例称取半枝莲 15 g、白花蛇舌草                        值（A）并计算细胞增殖率：细胞增殖率＝（实验组48 h时
        15 g、三棱 10 g、莪术 10 g、（制）乳香 4 g、（制）没药 4 g、           的A值－实验组0 h时的A值）/（正常对照组48 h时的A
        橘核10 g、皂角刺15 g、海藻30 g、牡蛎（先煎）30 g、石见                 值－正常对照组0 h时的A值）×100％。
        穿 15 g 和荔枝核 10 g，加水 300 mL 煎煮，煮沸后再文火                2.6  大鼠子宫平滑肌瘤细胞相对迁移率的检测
        煎煮10 min，收集药液；药渣再加水200 mL，煮沸后再文                         采用细胞划痕实验进行检测。将从模型组和各给
        火煎煮 30 min，收集药液，合并后滤过，将滤液浓缩至                        药组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑
        112 mL（以生药总量计质量浓度为1.5 g/mL），即得。                     肌瘤细胞以 5×10 个/孔接种于 6 孔板中，每组设 6 个复
                                                                           5
        2.2  分组、造模与给药                                       孔。将各组细胞置于37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培养，
            将105只大鼠随机分为正常对照组、模型组、化学药                        待细胞贴壁且生长至 70％～80％时，用 200 µL 移液枪
        阳性对照组（米非司酮片 2.25 mg/kg ）、中药阳性对照                     枪头垂直划出“十”字划痕，用PBS轻柔洗去未贴壁的细
                                        [22]
        组（桂枝茯苓胶囊 200 mg/kg ）和消癥汤低、中、高剂量                     胞，加入 DMEM/F12 培养基（不含胎牛血清）适量，置于
                                 [23]
        组（1.4、2.8、5.6 g/kg，分别按临床成人用药量的 0.5、1、2              37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培养，利用倒置光学显微镜
        倍换算而得），每组15只。采用肌内注射雌激素和孕激                           对细胞板进行拍照，记录0 h和24 h时同一位置的照片，
                                         [24]
        素的方法建立大鼠子宫平滑肌瘤模型 ：除正常对照组                            并记录距划痕边缘一定距离的细胞数量。使用 Image J
        大鼠肌内注射等体积生理盐水外，其余各组大鼠同时                             v1.8.0 软件计算各组细胞的相对迁移率：相对迁移率
        肌内注射己烯雌酚（用大豆油稀释至 0.4 mg/mL）0.1                     （％）＝（实验组培养0 h时的细胞数量－实验组培养24 h
        mL+黄体酮（用大豆油稀释至 10 mg/mL）0.1 mL，每周 1                 时的细胞数量）/（模型组培养0 h时的细胞数量－模型组
        次，连续 15 周。自建模第 2 天起，各给药组大鼠灌胃相                       培养24 h时的细胞数量）×100％。实验重复3次。
        应药液（用生理盐水稀释），正常对照组和模型组大鼠灌                           2.7 大鼠子宫平滑肌瘤细胞凋亡率的检测
        胃等体积生理盐水，每天1次，连续4个月。                                    采用流式细胞术进行检测。将从模型组和各给药
        2.3  大鼠子宫形态的观察与子宫系数的检测                              组大鼠体内分离到的且处于对数生长期的子宫平滑肌
            末次给药后，称定各组大鼠体质量后断头处死，摘                          瘤细胞用含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL


        ·2452 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 20                                 中国药房    2021年第32卷第20期
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