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加入后，继续搅拌 15 min，即得 Cur-SLN 混悬液（以 Cur               10 min以热修复抗原；冷却后以PBS冲洗5 min×3次，滴
        计，质量浓度为0.77 mg/mL，载药量为7.72％）。                      加山羊血清进行封闭，室温静置 20 min；甩去多余液体，
        2.2 分组、造模与给药                                       滴加 LC3、Beclin-1一抗（稀释度均为1∶500）50 µL，室温
            将大鼠适应性喂养 7 d 后，分为假手术组、模型组、                     静置 1 h；以 PBS 冲洗 5 min×3 次，滴加二抗，室温孵育
        雷帕霉素组（阳性对照，2 mg/kg，剂量参考文献[10]设                     15 min；以PBS缓冲液冲洗3 min×3次，滴加辣根酶标记
        置）和 Cur-SLN 低、高剂量组（5、10 mg/kg，剂量参考文                的链霉卵白素-生物素免疫复合物适量，室温孵育 15
        献[11－12]设置），除模型组 13 只外，其余各组均 10 只。                 min；以PBS缓冲液冲洗3 min×3次，加入DAB显色液适
        除假手术组外，其余各组大鼠均采用腹主动脉缩窄合并                           量，室温孵育 8 min；采用光学显微镜进行观察，并拍
        肾急性缺血再灌注损伤法复制心肾综合征模型。具体                            照。当切片中呈现明显的棕黄色颗粒则为阳性表达，呈
        造模方法如下：大鼠腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉                       现不着色或浅色则为阴性表达。
        后，行腹部正中切开，沿腹白线进入腹腔，暴露分离左、                          2.7  大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达
        右侧肾蒂，阻断结扎 30 min 后，解除阻断，恢复血流，造                     水平检测
        成肾急性缺血再灌注损伤；随后，暴露分离后腹膜，沿游                              采用Western blot法进行检测。取“2.4”项下各组大
        离腹主动脉长轴置一折弯的 7 号针头，以 3-0 的丝线绕                      鼠心脏、肾、肺组织适量，经剪碎、裂解后，以12 000 r/min
        腹主动脉后与7号针头一起结扎，随后立即抽出针头，使                          离心5 min；取上清液，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定
        腹主动脉残留直径为 0.7 mm 的残腔，造成腹主动脉狭
                                                           蛋白浓度。蛋白经变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙
          [13]
        窄 。假手术组只同法分离肌肉、血管，但不阻断。术
                                                           烯酰胺电泳（SDS-PAGE），然后转膜 70 min，以 5％牛血
        后，在各组大鼠腹腔内滴入青霉素以预防感染，然后分
                                                           清白蛋白溶液室温封闭 2 h；以 TBST 洗膜 5 min×3 次，
        层关闭腹腔。造模8周后，取3只模型组大鼠，剖解其心
                                                           加入 LC3、Beclin-1、β-actin 一抗（稀释度均为 1 ∶ 500），
        肾组织进行观察，当出现心肌肥厚、肾肿大时，则表明造
                                                           4 ℃孵育过夜；以TBST洗膜5 min×3次，加入二抗（稀释
        模成功。造模成功后，各给药组大鼠均尾静脉注射相应
                                                           度为 1 ∶ 2 000），室温孵育 1 h；以 TBST 洗膜 5 min×3 次，
        药物（注射体积为 1 mL/kg），假手术组和模型组大鼠同
                                                           经ECL试剂显色后，置于凝胶成像系统中曝光成像。采
        法注射等体积生理盐水，每天1次，连续4周。
                                                           用 Image J 1.8.0 软件对蛋白条带的灰度值进行分析，以
        2.3  大鼠血清中ACE、FT3、AVP的含量测定
                                                           LC3、Beclin-1分别与内参β-actin灰度值的比值表示相应
            末次给药 24 h 后，将大鼠麻醉，于腹主动脉取血。
                                                           蛋白的表达水平。
        血样静置 30 min 后，以 3 500 r/min 离心 10 min，取上层
                                                           2.8  统计学方法
        血清，按 ELISA 试剂盒说明书相关方法操作，采用酶标
                                                               采用 SPSS 21.0 对数据进行统计分析，数据以 x±s
        仪于450 nm波长下测定血清中ACE、FT3、AVP的含量。
                                                           表示。多组间比较，若数据符合正态分布且方差齐性，
        2.4  大鼠心脏、肾、肺指数的测定
                                                           则采用单因素方差分析；若方差不齐，则采用 Kruskal-
            取血完成后，处死大鼠，取其心脏、肾、肺组织；分离
                                                           Wallis H检验。组间两两比较采用LSD检验。检验水准
        心肌组织后，称定心脏湿质量、肾湿质量、肺湿质量，然
                                                           α＝0.05。
        后计算各脏器指数（脏器指数＝脏器湿质量/体质量×
                                                           3 结果
        100％）。
        2.5  大鼠心脏、肾、肺组织病理学形态观察                             3.1  大鼠血清中ACE、FT3、AVP含量的测定结果
            取“2.4”项下各组大鼠心脏、肾、肺组织适量，置于                          与假手术组比较，模型组大鼠血清中 ACE、FT3 含
        4％多聚甲醛溶液中固定，经70％、80％、90％、95％乙醇                     量均显著升高（P＜0.01），AVP含量显著降低（P＜0.01）。
        和无水乙醇梯度脱水，再以二甲苯透明替换、浸蜡、包                           与模型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠血
        埋、切片（厚度约5 μm）。各组大鼠均取2张相应脏器切                        清中 ACE、FT3 含量均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），
        片进行苏木精-伊红（HE）染色（另外 3 张切片后续进行                       AVP含量（雷帕霉素组除外）均显著升高（P＜0.05）。结
        免疫组化实验），然后于光学显微镜下观察其心脏、肾、                          果见表1。
        肺组织的病理学形态。                                         3.2 大鼠心脏、肾、肺指数的测定结果
        2.6  大鼠心脏、肾、肺组织中细胞自噬相关因子的表达                            与假手术组比较，模型组大鼠心脏指数、肾指数均
        分布检测                                               显著升高（P＜0.01），肺指数显著降低（P＜0.01）。与模
            采用免疫组化法进行检测。取“2.5”项下各组大鼠                       型组比较，雷帕霉素组和Cur-SLN各剂量组大鼠心脏指
        另外3张相应脏器切片，经脱蜡并复水后，以磷酸盐缓冲                          数、肾指数均显著降低（P＜0.01），肺指数（Cur-SLN高剂
        液（PBS）冲洗 5 min×3 次，滴加 3％H2O2，室温静置 10               量组除外）均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。结果见
        min；以 PBS 冲洗 5 min×3 次，置于枸橼酸钠溶液中煮沸                 表2。


        中国药房    2021年第32卷第19期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 19  ·2349 ·
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