Page 33 - 2021年17期
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2 方法                                               流式细胞仪检测。使用 ModFit LT 4.1 细胞周期分析软
        2.1 细胞的培养及分组                                       件处理，记录各周期的细胞分布情况。
            将SK-BR-3细胞接种于含10％FBS、100 U/mL青霉                2.5 细胞凋亡和周期相关蛋白表达情况检测
        素和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基（以下简称                          采用 Western blot 法进行检测。取对数增殖期的
       “完全培养基”）中，置于37 ℃、5％CO2、97％湿度的培养                     SK-BR-3 细胞，用完全培养基重悬，制成密度为 5×10                  6
                                                              －1
        箱中培养（培养条件下同），待细胞融合至 85％时用                          mL 的悬液，按每皿 3 mL 接种至直径 60 mm 的培养皿
        0.25％胰酶消化，再进行传代培养并用于后续实验。取                         中，培养 24 h。按“2.3”项下方法将细胞分组，每组设 3
        对数增殖期的 SK-BR-3 细胞，随机分为空白对照组和                       个平行皿。空白对照组加入完全培养基3 mL，各药物组
        COS 10、20、30、40、50 μmol/L组。空白对照组仅加入完               加入含相应药物的完全培养基3 mL；培养48 h后，加入
        全培养基（下同），COS组分别加入含COS终浓度为10、                       RIPA裂解液裂解细胞，并收集蛋白，采用BCA法测定蛋
        20、30、40、50 μmol/L 的完全培养基。上述 COS 的给药               白浓度。蛋白经煮沸变性后，取适量行十二烷基硫酸
        浓度参考文献[9－10]和本课题组前期预实验结果设置。                        钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移至PVDF膜上；以5％
        2.2 细胞增殖活性检测                                       脱脂奶粉于室温下封闭 2 h，用 TBST 缓冲液洗涤 3 次；
            采用 MTT 法进行检测。取对数增殖期的 SK-BR-3                   加 入 p53、caspase-3、Bcl-2、Bax、p21、CDK2、cyclinE、
                                                  －1
        细胞，用完全培养基重悬，制成密度为 6×10 mL 的悬                       β-actin一抗（稀释度均为1∶1 000），4 ℃孵育过夜；用TBST
                                              4
        液，按每孔100 μL接种至96孔板中，培养24 h。按“2.1”                  缓冲液洗涤 3 次，加入相应二抗（稀释度为 1 ∶ 3 000），室
        项下方法将细胞分组，每组设9个复孔。空白对照组加                           温孵育2 h；加入ECL化学发光显色液显色后，置于化学
        入完全培养基100 μL，各药物组加入含相应药物的完全                        发光成像系统下成像。使用Quantity One V4.6.6图像分
        培养基 100 μL；分别于培养 24、48、72 h 时，加入终质量                析软件对蛋白条带灰度值进行分析，以目标蛋白与内参
        浓度为 0.5 mg/mL 的 MTT 试剂 50 μL，继续培养 4 h；吸            蛋白（β-actin）的灰度值比值表示目标蛋白的相对表
        弃培养基，加入 DMSO 150 μL，于摇床上振摇 1～2 min                 达量。
        后，使用酶标仪于 490 nm 波长处检测各孔的光密度                        2.6  统计学方法
       （OD）值并计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率＝                                使用SPSS 18.0软件进行统计分析。数据均以x±s
       （OD 空白对照组－OD 检测组 ）/OD 空白对照组×100％。                   表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较
        2.3  细胞凋亡率检测                                       采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
            采用 Hoechst 33258 荧光染色法进行检测。取对数                 3 结果
        增殖期的 SK-BR-3 细胞，用完全培养基重悬，制成密度                      3.1  COS对SK-BR-3细胞增殖的影响
        为5×10 mL 的悬液，按每孔2 mL接种至含无菌盖玻片                          与空白对照组比较，不同浓度的COS均能显著抑制
              4
                  －1
        的 6 孔板中，培养 24 h。将细胞随机分为空白对照组和                      SK-BR-3 细胞的增殖（P＜0.05 或 P＜0.01），并呈浓度、
        COS低、中、高浓度组（10、20、30 μmol/L，剂量参考“2.2”              时间依赖趋势，详见表 1。同时，在研究过程中笔者发
        项下结果设置），每组设3个复孔。空白对照组加入完全                          现，当COS浓度较高（40、50 μmol/L）、作用时间较长（72
        培养基2 mL，各药物组加入含相应药物的完全培养基2                         h）时，细胞大量死亡、漂浮，而贴壁细胞较少，故最终选
        mL；培养48 h后，按Hoechst 33258荧光染色试剂盒说明                 择 10、20、30 μmol/L 的 COS 作用 48 h 作为后续实验的
        书方法进行固定、染色，并置于倒置荧光显微镜下观察                           条件。
        并拍照，并参考文献[11]方法计算细胞凋亡率：细胞凋亡                        表 1   COS 不同浓度和时间作用下 SK-BR-3 细胞的生
                                                                 长抑制率检测结果（x±±s，n＝9，％％）
        率＝凋亡细胞数/细胞总数×100％。
        2.4 细胞周期分布情况检测                                     Tab 1 Inhibitory rates of the proliferation of SK-
                                                                   BR-3 cells after treated with different concen-
            采 用 流 式 细 胞 仪 进 行 检 测 。 取 对 数 增 殖 期 的
                                                                   trations of COS for different time（x±±s，n＝
        SK-BR-3 细胞，用完全培养基重悬，制成密度为 5×10                 4
                                                                   9，％％）
        mL 的悬液，按每皿 3 mL 接种至直径 60 mm 的培养皿
           －1
        中，培养 24 h。按“2.3”项下方法将细胞分组，每组设 3                     组别             24 h         48 h         72 h
                                                            空白对照组           0            0           0
        个平行皿。空白对照组加入完全培养基3 mL，各药物组                          COS 10 μmol/L组  10.324±4.808 ＊  15.176±3.289 ＊  34.538±5.453 ＊＊
        加入含相应药物的完全培养基3 mL；培养48 h后，收集                        COS 20 μmol/L组  53.161±2.747 ＊＊  64.530±3.672 ＊＊  85.497±4.063 ＊＊
        细胞，加入 70％乙醇于 4 ℃下固定过夜，随后用预冷的                        COS 30 μmol/L组  63.793±2.740 ＊＊  79.829±3.295 ＊＊  88.740±3.512 ＊＊
                                                            COS 40 μmol/L组  72.124±4.061 ＊＊  86.231±3.506 ＊＊  90.717±2.645 ＊＊
        磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤 2 次，加入 RNase A 试
                                                            COS 50 μmol/L组  88.380±3.849 ＊＊  92.129±1.579 ＊＊  93.969±2.713 ＊＊
        剂100 μL重悬，于37 ℃水浴中孵育30 min；加入PI染色                      注：与空白对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
                                                                               ＊
                                                                                      ＊＊
        液500 μL，混匀，于4 ℃避光条件下孵育30 min后，使用                       Note：vs. blank control group，P＜0.05， P＜0.01
                                                                                         ＊＊
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        中国药房    2021年第32卷第17期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 17  ·2075 ·
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