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2.8 PC3细胞中β-catenin信号通路相关基因mRNA表 据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。检验
达的检测 水准α＝0.05。
采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）进行检测。取 3 结果
对数生长期的 PC3 细胞，按“2.4”项下方法分组与给药 3.1 AECC对PC3细胞增殖的影响
（因烟管头草高质量浓度组细胞存活数较少，无法提取 培养24、48、72 h后，与对照组比较，AECC各质量浓
相关基因 mRNA 和蛋白，故后续仅进行其低、中质量浓 度组细胞存活率均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；且随
度组的相关检测）；收集各组细胞，分别加入 Trizol 试剂 AECC质量浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率
提取总 RNA，再逆转录合成 cDNA，以 cDNA 为模板进 呈下降趋势，详见表 2。当 AECC 质量浓度为 20 μg/L、
行 PCR 扩增。PCR 反应体系（50 µL）为：cDNA 模板 2 作用 24 h 时，细胞存活率为（69.45±0.92）％，提示该质
µL、2× UltraSYBR Mixture（High Rox）25 µL、上下游引 量浓度提取物对PC3细胞有显著的抑制作用，因此分别
物各1 µL、ddH2O 21 µL（PCR引物序列和产物长度见表 设置 20、40、80 μg/L 为 AECC 的低、中、高质量浓度，并
1）。PCR 扩增条件为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 选择24 h为其作用时间。
s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，循环40次。以GADPH 表2 不同质量浓度AECC作用不同时间后对PC3细胞
为内参，采用 2 － ΔΔCt 法计算β-catenin、MMP-7、c-Myc、 存活率的影响（x±±s，n＝3，％％）
caspase-3、Bcl-2、Bax 的 mRNA 表达水平。上述实验重 Tab 2 Effects of different concentrations of AECC for
复3次。 different time on survival rate of PC3 cells（x±±
表1 PCR引物序列和产物长度 s，n＝3，％％）
Tab 1 PCR primer sequence and product length
组别 细胞存活率
基因名称 引物序列 产物长度，bp 培养24 h 培养48 h 培养72 h
β-catenin 上游：5′-GGCTCTTGTGCGTACTGTCC-3′ 109 对照组 98.28±1.93 99.40±1.21 101.12±1.09
下游：5′-GGCCATCTCTGCTTCTTGGT-3′ AECC 5 μg/L 组 94.55±1.13 ＊ 93.94±2.02 ＊ 94.21±2.67 ＊
MMP-7 上游：5′-CATGATTGGCTTTGCGCGAG-3′ 150 AECC 10 μg/L组 88.48±3.74 ＊ 83.51±4.041 ＊＊ 82.43±4.731 ＊＊
下游：5′-AGACTGCTACCATCCGTCCA-3′ AECC 20 μg/L组 69.45±0.92 ＊＊ 58.52±1.67 ＊＊ 40.18±1.28 ＊＊
c-Myc 上游：5′-GCCAGAGGAGGAACGAGCTA-3′ 130 AECC 40 μg/L组 50.08±1.55 ＊＊ 40.21±4.48 ＊＊ 28.09±1.86 ＊＊
下游：5′-TGGACGGACAGGATGTATGC-3′ AECC 80 μg/L组 36.61±3.68 ＊＊ 29.88±2.49 ＊＊ 18.50±1.36 ＊＊
caspase-3 上游：5′-GAAATTGTGGAATTGATGCGTGA-3′ 164 ＊ ＊＊
注：与对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
下游：5′-CTACAACGATCCCCTCTGAAAAA-3′ Note：vs. control group，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
Bcl-2 上游：5′-GTACTTAAAAAATACAACATCACAG-3′ 148
下游：5′-CTTGATTCTGGTGTTTCCC-3′ 3.2 AECC对PC3细胞凋亡的影响
Bax 上游：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′ 155 Hoechst 33258 染色结果显示，对照组细胞形态饱
下游：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′ 满、染色面积广；烟管头草各质量浓度组随给药浓度增
GAPDH 上游：5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′ 274
下游：5′-ATGACCTTGCCCACAGCCT-3′ 加，细胞数目减少，染色面积减少，凋亡细胞呈现较强蓝
2.9 PC3 细胞中β-catenin 信号通路相关蛋白表达的 白色荧光，详见图1。流式细胞仪检测结果显示，与对照
检测 组比较，AECC各质量浓度组细胞早期凋亡率（中质量浓
采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的 度组除外）均显著降低，晚期凋亡率均显著升高（P＜
PC3细胞，按“2.4”项下方法接种、分组与给药后，收集细 0.01），详见表3、图2。
胞；采用全蛋白提取试剂盒提取蛋白，以BCA蛋白浓度 3.3 AECC对PC3细胞迁移和侵袭能力的影响
测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经变性后进行十二烷 与对照组比较，AECC 各质量浓度组细胞的迁移数
基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳，转膜，以 5％脱脂牛奶封闭 和侵袭数均显著降低（P＜0.01），详见表4、图3。
1 h；以 TBST 缓冲液洗涤 10 min×3 次，加入β-catenin、 3.4 AECC 对 PC3 细胞中β-catenin 信号通路相关基因
MMP-7、c-Myc、caspase-3、Bcl-2、Bax、GAPDH 一抗（稀 mRNA和蛋白表达的影响
释比例均为1∶1 000），于4 ℃条件下孵育过夜；以TBST缓 与对照组比较，AECC 中剂量组细胞中 MMP-7、
冲液洗涤10 min×3次，加入二抗（稀释比例为1∶30 000）， c-Myc、Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P＜
避光孵育 2 h；以 TBST 缓冲液洗涤 10 min×3 次，经双色 0.05 或 P＜0.01），β-catenin、caspase-3、Bax 的 mRNA 和
红外激光扫描成像仪成像。采用Image J 1.8.0软件进行 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；AECC低剂量组细
分析，以目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值 胞中 MMP-7 的 mRNA 和蛋白表达水平以及 Bcl-2 的蛋
表示目标蛋白的表达水平。上述实验重复3次。 白表达水平均显著降低（P＜0.05），β-catenin 的 mRNA
2.10 统计学方法 和蛋白表达水平以及 Bax 的蛋白表达水平均显著升高
采用 GraphPad Prism 7.0 进行数据的统计分析。数 （P＜0.05或P＜0.01），详见表5、表6、图4。

中国药房 2021年第32卷第15期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 15 ·1833 ·