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Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（美国 Becton               清；沉淀中加入 DMSO 150 μL，采用酶标仪于 490 nm
        Dickson 公 司 ，批 号 40302ES20），四 甲 基 偶 氮 唑 蓝           波长处测定各孔吸光度（OD），然后按照文献[13]方法，
        （MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、青链霉素混合液、0.1％结                     计算细胞存活率[细胞存活率（％）＝（OD 实验组－OD 空白组 ）/
        晶紫染色液、全蛋白提取试剂盒（北京索莱宝科技有限                           （OD 对照组－OD 空白组 ）×100％]。上述实验重复3次。
        公 司 ，批 号 分 别 为 298931、D8370、20201203、P7630、         2.4 PC3细胞分组与给药
                                                                                              5
        BC3711），Hoechst 33258 染色试剂盒、BCA 蛋白浓度测                   取对数生长期的PC3细胞，以5×10 个/皿接种于60
                                                               3
        定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶配制试剂                            mm 的培养皿中，加入完全培养基 5 mL ，于 37 ℃、5％
        盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为C0003、                         CO2细胞培养箱中培养24 h；待细胞贴壁后，随机分成对
        PC0020、P0012AC），PCR 试剂盒（北京康为世纪生物科                   照组和 AECC 低、中、高质量浓度组（20、40、80 μg/L，质
        技有限公司，批号 CW2569M），兔 Bcl-2 单克隆抗体、兔                   量浓度根据“2.3”项下结果设置），每组设置 3 个平行
        Bax 单 克 隆 抗 体（美 国 Abcam 公 司 ，批 号 分 别 为              皿。对照组加入含 0.1％DMSO 的完全培养基 5 mL，
        ab32124、ab32503），兔GAPDH单克隆抗体、兔caspase-3             AECC 各质量浓度组加入含相应药物的完全培养基 5
        单克隆抗体、兔 c-Myc 单克隆抗体、兔 MMP-7 多克隆抗                    mL，培养24 h后，进行后续实验。
        体、兔β-catenin 单克隆抗体、DyLight      TM  800 标记的山羊       2.5 PC3细胞凋亡情况的检测
                                                            2.5.1 Hoechst 33258 染色实验     取对数生长期的 PC3
        抗兔免疫球蛋白 G（H+L）二抗（美国 CST 公司，批号分
                                                            细胞，按“2.3”项下方法接种、分组与给药后，收集细胞，
        别为5174、9665、13987、71031、8480、5151）；PCR引物由
                                                            分别取适量制成密度为1×10 mL 的均匀细胞液；取上
                                                                                         －1
                                                                                     5
        生工生物工程（上海）股份有限公司设计与合成，水为纯
                                                            述细胞液 10 µL 滴于载玻片上，加入固定液 10 µL，固定
        净水。
                                                            20 min；弃固定液，以 PBS 清洗 3 次，每次 5 min；加入
        1.3  细胞
                                                            Hoechst 33258 染色液 10 µL，避光染色 15 min；弃染色
            本研究所用前列腺癌 PC3 细胞购自中国科学院上
                                                            液，以PBS清洗3次，每次5 min。取洁净的盖玻片，滴加
        海生科院细胞资源中心，保存于贵州省中国科学院天然
                                                            少许荧光淬灭液，盖于上述载玻片上。采用荧光显微镜
        产物重点实验室。
                                                            进行观察，各组细胞选取3个视野，在DAPI通道下观察
        2 方法
                                                            并拍照（镜下凋亡细胞呈蓝白色荧光）。上述实验重复
        2.1  AECC的制备
                                                            3次。
            取烟管头草1 kg，粉碎，以2 L水加热回流提取1 h，
                                                            2.5.2  流式细胞仪检测实验           取“2.5.1”项下收集的各
        共提取3次，过滤；合并3次滤液，浓缩，即得烟管头草浸
                                                                                           5
                                                            组 PC3 细胞适量，制成密度为 5×10 mL           －1 的均匀细胞
        膏（约246 g）。称取上述浸膏0.2 g，加入DMSO 1 mL溶
                                                            液，按试剂盒说明书相关方法操作后，以200目细胞筛过
        解，然后加水 49 mL，制成质量浓度为 4.0 g/L 的 AECC
                                                            滤，滤液采用流式细胞仪进行检测，并计数各组细胞凋
        母液，备用。
                                                            亡率。上述实验重复3次。
        2.2  细胞培养
                                                            2.6  PC3细胞迁移能力的检测
            PC3 细胞采用含 10％胎牛血清和 1％青霉素-链霉                         将PC3细胞以DMEM高糖培养基培养24 h，使其处
        素双抗的 DMEM 高糖培养基（简称“完全培养基”），于                        于饥饿状态；然后以1×10 个/孔接种于Transwell小室上
                                                                                  5
        37 ℃、5％CO2细胞培养箱中培养，取对数生长期的细胞                        层，培养 24 h 使细胞贴壁，同时在 Transwell 小室下层加
        进行后续实验。                                             入完全培养基750 µL。按“2.4”项下方法分组、给药后，
        2.3 PC3细胞存活率的检测                                     取出小室，用棉签擦拭小室上层内侧底部细胞以清除未
            采用 MTT 法进行检测。取对数生长期 PC3 细胞，                     迁移的细胞，然后置于甲醇中固定 15 min，再以 0.1％结
        以 5 000 个/孔接种于 96 孔板中，每孔 100 µL，于 37 ℃、             晶紫染色液染色20 min。在显微镜下选取3个视野进行
        5％CO2细胞培养箱中培养 24 h；待细胞贴壁后，随机分                       观察（迁移细胞被染成紫色），计算各组细胞迁移数。上
        为对照组和 AECC 不同质量浓度组（5、10、20、40、80                    述实验重复3次。
        μg/L，质量浓度参考文献[9]设置），另设不含细胞只含完                       2.7 PC3细胞侵袭能力的检测
        全培养基的空白组，每组设置5个复孔。对照组加入含                                将 Matrigel 胶低温解冻后，加入 6 倍体积 DMEM 高
        0.1％DMSO的完全培养基100 μL，AECC各质量浓度组                     糖 培 养 基 稀 释 混 匀 。 将 稀 释 后 的 Matrigel 胶 铺 于
        分别加入含相应药物的完全培养基100 µL，分别于培养                         Transwell 小室滤膜上层，放至凝固；然后后续操作同
        24、48、72 h 时，向各组细胞加入 MTT 溶液 20 μL，于                “2.6”项下方法。在显微镜下选取3个视野进行观察，计
        37 ℃条件下孵育4 h后，以2 500 r/min离心15 min，弃上               算各组细胞侵袭数。上述实验重复3次。


        ·1832 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 15                                 中国药房    2021年第32卷第15期
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